人IgG四亚类对噬菌体展示Ig结合蛋白单结构域随机组合文库的体外进化筛选

金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A,SpA)和链球菌蛋白G(Streptococcal protein G,SpG)是细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins,IBPs)的代表分子。SpA和SpG均包含由多个序列高度同源的结合结构域重复组成的抗体结合区,各单结构域都具有完全的结合IgG的功能。为研究这些单结构域随机组合能否产生具有新结合特性的组合分子,将SpA的A、B、C、D、E以及SpG的B2、B3共7个单结合结构域随机组合构建成噬菌体展示文库后,应用人IgG1、2、3、4为诱饵分子对该文库进行4轮筛选,获得了SpA天然分子中不存在的单结构域排列组合分子D-C。在筛选过程中,阴性对照噬菌体的逐渐减少、展示两个结构域以上的噬菌体比例不断增多,尤其是D-C组合的选择性富集和其随机连接肽的严格筛选都显示了筛选的有效性和D-C组合的重要性。噬菌体ELISA进一步证实D-C与人IgG四亚类的结合能力远强于天然SpA分子。该研究应用分子进化技术首次获得了一种与人IgG四亚类具有结合优势的新型组合分子D-C,不仅可为IgG纯化、制备、检测等方面的应用提供新的候选分子,还为细菌IBP结构功能的进一步研究提供新的手段。     

金黄色葡萄球菌A蛋白基因的克隆及序列分析

 我们构建了金黄色葡萄球菌Cowan1株(CMCC26111)的染色体文库,转化大肠杆菌后筛选出一株protein A的阳性克隆。SDS-PAGE及Western-blot结果显示该克隆株表达的重组protein A的分子量为30 000,较天然protein A的小。该克隆中的protein A基因片段的序列分析表明,它含有天然protein A基因的启动子、信号肽以及至少四个与IgGFc段结合的结构域,而不含天然protein A的胞壁结合区,并发现其中有24个碱基对与Uhlen报告的protein A基因不同,由此导致三个编码的氨基酸发生变化,但这些差异并不影响该重组protein A与IgG Fc段的特异结合。     

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列（NNK）₁₀的寡核苷酸片段,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒pCANTAB5E的SfiⅠ,NotⅠ位点,即cpⅢ蛋白信号肽与成熟肽之间,电转化E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库,实际库容为3.53×10⁷,插入率为66.7%.经辅助噬菌体M13KO7超感染后,获得滴度为4.8 ×10¹¹ pfu/ml的噬菌体上清.经过两轮panning筛选和富集,从构建的随机十肽库中筛选到26个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆,对其中12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析,ELISA检测结果显示12个阳性噬菌体克隆都能够与血管形成素特异性结合.     

驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定

从未经主动免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录后作为第一轮PCR的模板。根据重链抗体保守区域设计引物,经巢式PCR法扩增获得了全套重链抗体可变区基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库NAL,含有2×10⁷个独立克隆,菌落PCR和Hinf I酶切分析结果显示,克隆效率大于97%,文库的多样性良好。辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库命名为NA-PDL,滴度达10¹³CFU/ml。以真菌毒素人工抗原DON-MBSA为目标抗原,对NA-PDL进行了淘选,第二轮洗脱物中,阳性克隆率达36.4%,提示针对目标抗原的噬菌体颗粒得到了有效富集,文库NA-PDL多样性较好,为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。     

Cd2+结合肽的筛选及与重金属离子的亲和作用*

利用噬菌体随机十二肽库和亲和层析技术对重金属Cd进行亲和筛选,共获得两条Cd结合肽序列。将展示有Cd²⁺结合肽的噬菌体单克隆扩增物对不同重金属离子(Cd²⁺、Cr²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺)螯合的树脂进行亲和测定,结果表明Cu²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ni^2+<     

抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

克隆了6株稳定分泌抗腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并鉴定或测定了其中3株细胞所分泌抗体的亚型和分子量.通过测定抗体和固相及均相抗原的结合能力,发现McAb3D3与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为8.4×10⁸和7.0×10~4(mol·L^-1)^-1,而McAb4D8与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为9.6×10⁸和3.9×10⁶(mol·L.¹)^-1McAb3D3和McAb4D8与不同存在形式抗原之间亲和常数如此大的差别,说明这2个抗体更适合与固定化腺苷酸激酶的结合.由于蛋白质分子常因吸附在酶标板上而发生部分变性,所以用间接ELISA方法筛选出的单克隆抗体McAb3D3和McAb4D8可能是针对部分变性腺苷酸激酶分子的.这2种抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定为我们进一步将其用于蛋白质折叠机制的研究奠定了基础.     

利用噬菌体展示文库筛选纤维素结合结构基元

从编码随机１５肽序列的噬菌体表面展示文库中,筛选得到了与纤维素有特异亲和能力的噬菌体克隆。序列分析结果表明,这些噬菌体克隆编码的氨基酸序列中芒香族氨基酸残基高度保守,与天然纤维素结合结构域的结构有一定的类似性。     

噬菌体抗体库的构建及抗乳腺癌细胞单链抗体的筛选

构建抗人乳腺癌细胞MCF 7的噬菌体单链抗体库 ,从中筛选MCF 7细胞特异性单链抗体。用MCF-7细胞免疫BALB C小鼠 ,取脾脏 ,提取总RNA ,用RT-PCR技术扩增小鼠抗体重链 (V_H)和轻链 (V_L)可变区基因 ,经重叠PCR(SOE-PCR) ,在体外将V_H和V_{L连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,电转化至大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体超感染 ,构建噬菌体单链抗体库。从该抗体库中筛选特异性识别MCF-7细胞的噬菌体单链抗体 ,将表面展示单链抗体的单克隆噬菌体转化大肠杆菌TOP10进行可溶性表达。成功地构建了库容为12×10⁶ 的抗MCF-7乳腺癌细胞的单链抗体库 ,初步筛选到了与MCF 7细胞特异性结合的scFv,Westernblot检测表明 ,在大肠杆菌TOP10中实现了单链抗体可溶性表达}     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。     

从噬菌体表面展示肽库中筛选志贺毒素受体结合抑制剂

利用抗体捕获法 ,从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与志贺毒素B亚基 (StxB)结合 ,并能抑制志贺毒素细胞毒效应的噬菌体克隆 ;依据其中 1个克隆序列 (A12 )合成的肽可以与志贺毒素的受体Gb3竞争结合StxB ,并抑制志贺毒素(Stx)的细胞毒和肠毒活性 ;抑制 5×CD₅₀ 剂量的Stx细胞毒效应需 2 2 .7μmol的A12合成肽 .筛选得到的 2个噬菌体克隆 (A3 ,A12 )编码的氨基酸序列不同 ,但能竞争结合StxB ,推测它们形成相同或相似的空间结构 .为志贺毒素抑制剂进一步研究打下基础 ,对其他相关药物的研制亦有参考价值 .     

蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A的表达及性质的研究

克隆了Aspergillus niger T21中的蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A（PRPA）基因,并将它插入pET23b表达载体。在E. coli中表达时,PRPA占菌体总蛋白的34%。经过超声破细胞、硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。PRPA有二硫键异构酶活性。在PRPA存在下,变性和还原的溶菌酶复性率和复性速度降低,电泳结果表明溶菌酶聚集增多。荧光结果表明PRPA表面有较多的疏水基团。     

植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白研究进展

综述了近十年来国内外有关研究植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白的文献,着重阐述了磷胁迫和铁胁迫条件下的植物蛋白质变化,如新的蛋白和新的多肽的特异产生,以及相关的分子生物学进展。     

蛋白质相互作用研究的新技术与新方法

目前,蛋白质相互作用已成为蛋白质组学研究的热点. 新方法的建立及对已有技术的改进标志着蛋白质相互作用研究的不断发展和完善．在技术改进方面,本文介绍了弥补酵母双杂交的蛋白定位受限等缺陷的细菌双杂交系统;根据目标蛋白特性设计和修饰TAP标签来满足复合体研究要求的串联亲和纯化技术,以及在双分子荧光互补基础上发展的动态检测多个蛋白质间瞬时、弱相互作用的多分子荧光互补技术．还综述了近两年建立的新方法：与免疫共沉淀相比,寡沉淀技术直接研究具有活性的蛋白质复合体;减量式定量免疫沉淀方法排除了蛋白质复合体中非特异性相互作用的干扰;原位操作的多表位－配基绘图法避免了样品间差异的影响,以及利用多点吸附和交联加固研究弱蛋白质相互作用的固相蛋白质组学方法.     

苜蓿盐适应愈伤组织中蛋白质性质和组分的变化

通过一步筛选获得1.0％NaCl适应愈伤组织。在盐适应愈伤组织中水溶性蛋白和稀碱提取蛋白含量增加,而脂溶性蛋白含量没有明显变化。盐适应愈伤组织水溶性蛋白热稳定性下降;总蛋白抗脱水能力增强。盐适应愈伤组织水溶性蛋白在K~ 存在时,262nm吸收峰增高。盐适应愈伤组织蛋白氨基酸组成发生变化,其中最为明显的是Tyr摩尔百分数增加。Lys摩尔百分数减少。 盐适应愈伤组织中24kD蛋白含量明显增加。应用IEF-,NEPHGE-和native-PAGE-SDS-PAGE三种双向电泳方法同时证明在盐适应愈伤组织蛋白组分与非适应愈伤组织有明显差别。     

眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBank登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。     

酪氨酸蛋白激酶和蛋白激酶C对N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V的双重调控

在人肝癌细胞７７２１中研究了酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）和蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的激活剂［分别为表皮生长因子（ＥＧＦ）和佛波酯（ＰＭＡ）］和各种蛋白激酶抑制剂对Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｖ（ＧｎＴ－Ｖ）活力的影响,以探讨ＴＰＫ和ＰＫＣ对ＧｎＴ－Ｖ的调节。结果发现,ＥＧＦ或ＰＭＡ处理细胞４８ｈ后,ＧｎＴ－Ｖ的活力明显增高;蛋白激酶的非特异性抑制剂槲皮素和染料木黄酮（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）在抑制ＴＰＫ和ＰＫＣ的同时,抑制ＧｎＴ－Ｖ的基础活力,并完全阻断ＥＧＦ或ＰＭＡ对ＧｎＴ－Ｖ的增高作用;ＴＰＫ的特异性抑制剂Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ－２５和ＰＫＣ的特异性抑制剂Ｄ－鞘氨醇分别应用时,各自只能部分地取消ＥＧＦ或ＰＭＡ对ＧｎＴ－Ｖ的诱导。但当Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ－２５和Ｄ－鞘氨醇同时加入培养基中则可完全阻断ＥＧＦ或ＰＭＡ对ＧｎＴ－Ｖ的诱导激活。蛋白质合成抑制剂环己亚胺和蛋白激酶抑制剂作用相仿,不但可抑制ＧｎＴ－Ｖ的基础活力,也可完全消除ＥＧＦ或ＰＭＡ对ＧｎＴ－Ｖ的激活。以上结果提示ＥＧＦ或ＰＭＡ通过蛋白激酶调节ＧｎＴ－Ｖ的酶蛋白合成,并且ＧｎＴ－Ｖ受到膜性ＴＰＫ和ＰＫＣ的双重调节,其中ｍ－ＴＰＫ较ｍ－ＰＫＣ更为重要。     

蛋白质剪切及其应用

蛋白质剪切是一种翻译后修饰事件 ,它将插入前体蛋白的中间的蛋白质肽段 (Intein ,internalproteinfrag ment)剪切出来 ,并用正常肽键将两侧蛋白质多肽链 (Extein ,flankingproteinfragments)连接起来。在此过程中不需要辅酶或辅助因子的作用 ,仅需四步分子内反应。Intein及其侧翼序列可以通过突变产生高度特异性的自我切割用于蛋白质纯化、蛋白质连接和蛋白质环化反应 ,在蛋白质工程方面有广泛的应用前景。     

SARS冠状病毒核壳蛋白对蛋白翻译的影响

目的:研究SARS冠状病毒核壳蛋白(N蛋白)对蛋白翻译的影响。方法:构建N蛋白表达载体FLAG-pcDNA3-N,分别与FLAG-pcDNA3和表达荧光素酶的质粒共转染293T人胚肾细胞,通过检测荧光素酶的活性来判断N蛋白对细胞内蛋白翻译的影响;在体外翻译体系中检测N蛋白对体外翻译的影响。结果:构建了载体FLAG-pcDNA3-N,在293T人胚肾细胞内表达后,荧光素酶活性被抑制;在体外翻译体系中加入N蛋白,体外翻译被抑制。结论:SARS冠状病毒N蛋白抑制蛋白翻译。     

蛋白质剪接及其在蛋白质工程中的应用

蛋白质剪接是蛋白质内含肽介导的,一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程,它由一系列分子内的剪切-连接反应组成。蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列,可以催化自身从蛋白质前体中断裂,使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质。蛋白质内含肽的发现,不仅丰富了遗传信息翻译后加工的理论,在实践中也有广泛的应用前景。Abstract: Protein splicing , which is an intein mediated posttranslational processing, involves a series of intramolecular cleavage-ligation reactions. Intein is an intervening polypeptide which can catalytic self-cleavage from a pre-protein accompanied by the concomitant joining of the two flanking polypeptides (the extein) through a peptide bond. Protein splicing not only enriches genetic theory of posttranslational processing, but also have wide application prospect.     

利用昆虫杆状病毒表达SARS冠状病毒的刺突蛋白和膜蛋白

SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。对其他种类冠状病毒的研究结果显示,刺突蛋白(S蛋白)和膜蛋白(M蛋白)是病毒主要的结构蛋白。重组M蛋白和S蛋白可被用来作为抗原检测冠状病毒的感染和制备疫苗。这两个蛋白质分别被克隆并重组到昆虫杆状病毒基因组中,利用重组杆状病毒感染昆虫细胞来表达重组M蛋白和S蛋白,并对M蛋白进行了细胞内定位,融合蛋白的绿色荧光暗示了该蛋白质定位在细胞膜上。