抗c-Myc标签纳米抗体的筛选与应用

目的: 以c-Myc-GST蛋白为靶分子,从纳米抗体噬菌体展示免疫文库中筛选能够特异性识别c-Myc标签(EQKLISEEDL)的纳米抗体。方法: 采用固相淘选技术,筛选出能与c-Myc标签特异性结合的噬菌体,phage-ELISA鉴定阳性克隆并测序,通过基因重组技术将阳性噬菌体编码的纳米抗体基因克隆至原核表达载体pET25b(+),再转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。采用间接ELISA和量子点免疫荧光法验证纳米抗体的结合活性和特异性。结果: 通过4轮固相淘选,具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,回收率提高了145倍,阳性率从20.83%提高至85.4%。将phage-ELISA鉴定显色值高的两个纳米抗体A25和A26分别进行了重组表达,SDS-PAGE结果显示均为可溶性表达,表达量为60 mg/L。间接ELISA结果表明重组蛋白A25和A26都能够识别c-Myc标签,量子点免疫荧光法验证得到纳米抗体A25能够对SP2/0细胞内的c-Myc蛋白进行检测。结论: 成功地筛选出与c-Myc标签结合的纳米抗体噬菌体克隆,构建了两个抗c-Myc标签纳米抗体的原核表达载体并实现了可溶性表达,为检测胞内c-Myc蛋白奠定了基础。     

驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定

从未经主动免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录后作为第一轮PCR的模板。根据重链抗体保守区域设计引物,经巢式PCR法扩增获得了全套重链抗体可变区基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库NAL,含有2×10⁷个独立克隆,菌落PCR和Hinf I酶切分析结果显示,克隆效率大于97%,文库的多样性良好。辅助噬菌体救援后,得到噬菌体展示文库命名为NA-PDL,滴度达10¹³CFU/ml。以真菌毒素人工抗原DON-MBSA为目标抗原,对NA-PDL进行了淘选,第二轮洗脱物中,阳性克隆率达36.4%,提示针对目标抗原的噬菌体颗粒得到了有效富集,文库NA-PDL多样性较好,为后续淘选针对特定抗原的单域重链抗体奠定了基础。     

两种水生动物抗菌肽的原核表达及活性分析

将两种水生动物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体,转化至E.coli Rosetta 中进行表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。融合蛋白经复性、酶切处理获得抗菌肽Y18和CEC1。抑菌实验结果表明:融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E. coli DH5α、S. aureus、B. subtilis和S. cerevisiae的生长。     

基于细胞的抗单增李斯特菌单域重链抗体的筛选及鉴定

【目的】获得针对单增李斯特菌的特异性单域重链抗体,并对筛选过程中特异性克隆的富集规律进行分析,为筛选具有种属特异性的噬菌体展示抗体提供参考。【方法】采用固相筛选技术,以热灭活的单增李斯特菌菌体为抗原,通过四轮常规筛选和一轮消减筛选,从驼源天然噬菌体展示文库中筛选针对单增李斯特菌的单域重链抗体。采用Phage-ELISA法,对后四轮筛选洗脱物中随机挑选的噬菌体进行鉴定,阳性克隆进行基因测序及结合特异性分析。通过多序列比对分析将获得的基因序列进行分组和统计。【结果】成功筛选到2株单增李斯特菌特异性的单域重链抗体。【结论】在优化的筛选条件下,基于全细胞的筛选方法能够获得特异性识别单增李斯特菌的单域重链抗体,消减筛选对于去除非特异性克隆是有效的和必要的。