重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测.方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞.经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd.运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性.结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性.结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.     

肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)cDNA的克隆、表达和活性测定

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 (TRAIL)能选择性诱导肿瘤细胞凋亡 .为利用基因工程技术获得重组TRAIL蛋白可溶性片段 (sTRAIL) ,设计 1对引物 .利用PCR技术特异性扩增出sTRAIL的cDNA ,克隆于质粒pGEM 3Zf( )的EcoRⅠ和PstⅠ位点 .经测序证明序列正确后克隆于表达质粒pBV2 2 0的EcoRⅠ和PstⅠ位点 ,转化大肠杆菌DH5α .转化菌株经温度诱导 ,SDS PAGE检测和Western印迹鉴定 ,获得重组sTRAIL的高水平非融合表达菌株 .表达量占菌体总蛋白的 2 0 % .对其表达产物进行了初步纯化 ,SDS PAGE结果显示纯度可达 90 %以上 .用L92 9细胞测定其生物学活性表明 ,重组蛋白在体外能明显诱导肿瘤细胞凋亡     

重组人胸腺素β4二串体蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的:获得具有生物学活性的重组人胸腺素β4二串体蛋白(Tβ4②)。方法:人工合成人Tβ4全长基因,构建Tβ4②基因,并将该基因克隆入载体pET-22b(+)中,转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经疏水作用层析纯化重组Tβ4②蛋白,采用Western印迹鉴定表达产物,并对其进行生物活性检测。结果:表达和纯化了Tβ4②蛋白,重组人Tβ4②在体外可促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。结论:重组人Tβ4②具有与化学合成Tβ4相同的功能,并有更高的生物学活性。     

人血管生成素-PE40融合蛋白基因的构建、表达及活性研究

利用 PCR扩增出人血管生成素 (h ANG)成熟肽的基因片段 .与绿脓杆菌外毒素缺失突变体PE40的基因连接后 ,克隆入 p UC1 9载体中 .测序后克隆入表达载体 p RSETB,构建成 h ANG-PE40融合基因的表达载体 .IPTG诱导 ,表达出分子量约为 58k D的 His6- ANG- PE40融合蛋白 ,占菌体总蛋白的 8% .Ni2 +- NTA树脂纯化表达蛋白 ,SDS- PAGE结果显示纯化重组蛋白为单一条带 .鸡胚绒毛尿囊膜鉴定表明重组蛋白体外能够有效地抑制血管的形成 .     

重组胸腺素α1的纯化及活性

将胸腺素α1基因4串体克隆于pThioHisA融合表达载体(pThioHisA-Tα1④),转化大肠杆菌TOP10。在IPTG诱导下,融合蛋白得到了高效表达。SDS-PAGE分析确定诱导表达的融合蛋白占菌体总蛋白的40%,且表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。把用离子交换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解,经简单的离子交换层析可纯化出胸腺素α1单体,HPLC鉴定胸腺素α1的纯度达98%。利用3H-TdR进行生物活性测定,证实融合蛋白和胸腺素α1单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下,刺激小鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力,与化学合成的胸腺素α1相比具有相似的生物活性。     

血管抑制素基因的克隆及表达

多年来,肿瘤的转移一直是肿瘤治疗的极大障碍,而血管抑制素(angiostatin)的发现很可能对肿瘤及其转移的治疗有重要意义。血管抑制素是从荷Luwis肿瘤小鼠血、尿中分离到的一种同源于纤维蛋白酶原内片段的多肽,在体外可抑制血管内皮细胞生长,在体内可显著抑制肿瘤组织转移及继发肿瘤的生长。故获得持续来源的血管抑制素对于肿瘤转移的治疗及     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

无标签人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基工程方法构建无标签人性脂联素球状结构(gAd)基的核表达载体,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化及鉴定.方法:从正常人脂肪组织里提取总 RNA,反转录合成 cDNA,经 PCR 扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒 pET-22b(+)-gAd,转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞,经低温、低浓度 IPTG 诱导使其可溶性表达,采用硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和离子交换层析三步分离纯化,得到不带任何标签的人性gAd;运用 SDS-PAGE、Western 印迹、HPLC 对重组蛋白进行鉴定,通过对 AMP 激活的蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平检测纯化蛋白的生物学活性.结果:构建了核表达载体 pET-22b(+)-gAd,实现了人性 gAd 在核细胞中的可溶性表达,纯化的蛋白经 SDS-PAGE 和 Western 印迹分析证实为 gAd,HPLC 分析蛋白纯度达到95%以上;通过对 AMPK磷酸化水平的检测,证明纯化的 gAd 具有高生物学活性.结论:重组表达和纯化了无标签、高生物学活性的人性脂联素球状结构,为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础.