野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析

野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10~(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000～5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16％。CHO-dhfr-细胞畸变率为6％。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。     

t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

组织型纤溶酶原激活剂工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

构建了突变体t-PA,使其在CHO-dhfr细胞中表达。获得t-PA工程细胞系。对该细胞系进行了遗传特性分析,在培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定处理并将细胞滴片、染色,进行染色体分析,结果表明,该工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒、四倍体、裂隙、断片、微小体,畸变率为15％,属于正常范围。同时进行成瘤性检测,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以人宫颈癌细胞(Hela细胞)为阳性对照,CHO-dhfr细胞为阴性对照,试验表明,t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅱ.t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr^- ),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000IU/10~6细胞·d^-1.重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体在CHO细胞中的高效表达

构建了二氢叶酸还原酶(dhfr)选择基因启动子上游无增强子(cnhancer)的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-dhfr~-)。用氨甲喋呤(MTX)筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10~(-7)mol/L MTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/10~6细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。     

人红细胞生成素(EPO)工程细胞建立及特性分析

构建了EPO真核表达质粒,成功地实现了其在CHOdhfr-细胞中的表达,所得到的EPO工程细胞株的形态与CHOdhfr-细胞相似,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为2～3μg/106cells/24h,而且细胞表达稳定,连续传代三个月和反复冻存复苏三次,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染,无致瘤性,形态正常,染色体畸变率与出发株相当。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA克隆片段。采用两种方式构建成真核表达质粒。第一:切除t-PA3＇端非编码区序列后插入SR启动子和SV_(40)晚期Poly(A)终止信号之间,形成pMGZ6001质粒;第二:将3＇端部分切除并带有Poly(A)加尾信号的t-PA片段插入由金属硫蛋白MT启动子调控的载体中,分别组建成含大T抗原与不含大T抗原的两个表达质粒pMGZ6002和pMGZ6003。这三种质粒用磷酸钙共沉淀法和电穿孔法转染CHO-dhfr细胞,阳性克隆细胞均能合成并分泌rt-PA。其分子量约68kD,并能与t-PA单克隆抗体特异结合,溶解纤维蛋白。阳性克隆经MTX选择培养扩增基因,培液中rt-PA表达水平可达3000IU/(10~6细胞·48h)。     

t-PA昆虫细胞表达及特性分析

应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PAcDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBactPA和线性化杆状病毒BacPAK6DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×103IU／ml,即相当于1.8×104IU／106细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kda左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）工程细胞系遗传特性及成瘤性分析

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)因其在防止血栓形成中起重要作用而受到人们的重视。但由于t-PA在血液中半衰期很短,作为溶栓药,一时难于推广。为了延长半衰期、增强其特异活性,本组构建了t-PA突变体并在CHO-dhfr~-细胞中获得了高效表达。我们在细胞培养基中加入秋水仙素,通过低张、固定、染色,进行染色体分析,结果表明,t-PA工程细胞系染色体条数为20条,畸变类型有异着丝粒。四倍体、裂隙、断片,畸变率为15％,属于正常范围。同时我们对该细胞系进行成瘤性试验,选用4周龄裸鼠作为试验鼠,以Hela细胞为阳性对照,CHO-dhfr~-细胞为阴性对照,试验表明:t-PA工程细胞及表达产物对裸鼠均无成瘤性。     

从SDS-PAGE中提纯t-PA及其抗原特性分析

为获纯度较高的t-PA抗原,对本组构建的表达t-PA的CHO工程细胞的无血清培养上清进行SDS-PAGE,铜染色,从中提纯少量抗原t-PA,获得高纯度的产物,蛋白回收率达88％。中和抑制实验表明,回收的目的蛋白能完全被t-PA抗血清所抑制。     

组建昆虫系统生物学的目的性和可行性探索

通过作在昆虫生物学方面近五十年研究工作的体会．提出了组建昆虫系统生物学的目的性和可行性探索．拟以昆虫分类序列目、科、属、种为单元,将一些已知种类的有关生物学环节．一一列叙．编成《中国农林昆虫系统生物学手册》．再以目、科、属、种为主体,探求彼此间在生物学各环节间的共性和个性,分别加以比较、归纳和分析．作为这—分支学科的蘸本。     

db-cAMP对转化细胞钙调素基因表达与细胞骨架的影响

转化的C_3H_(10)T_(1/2)细胞表现增殖速度加快、表面微绒毛增加,细胞变圆,叠层生长,ConA受体呈帽状分布,微管、微丝、纤粘蛋白分布明显减少。与增殖有关的癌基因c-fos表达增强,同时发现与细胞增殖、转化和细胞骨架调节有关的钙调素(CaM)基因表达加强。用1mmo/Ldb-cAMP处理转化细胞,观察到CaM基因和原癌基因c-fos的表达分别在处理后1小时和2小时急剧下降。处理后4—5天,转化细胞表型趋正常化,大部分细胞恢复单层生长。细胞表面微绒毛和泡状物减少,ConA受体帽状分布消失,恢复分散分布在细胞膜上的特点。细胞生长明显被抑制,用优先在G_1期表达的4F_1 cDNA为探针进行分子杂交,证实了经db-cAMP处理后的细胞被阻抑在G_1期。经db-cAMP处理6天的转化细胞中微管、微丝、纤粘蛋白基本恢复正常分布。实验表明CaM的表达增强与转化细胞表型变化和细胞骨架组装减弱密切相关,db-cAMP作用后CaM表达下降是抑制转化细胞增殖并使细胞表型和细胞骨架分布趋于正常的关键事件之一。     

多种神经活性物质在幼年猫和鸡视网膜神经细胞中的共存(简报)

视网膜起源于前脑泡,结构简单层次分明,因此常被视为脑的简化模型。但近期工作证明,视网膜包含的神经活性物质(神经递质、调质和神经肽)种类之多、分布之复杂并不亚于脑。尤其是无长突细胞不仅包含多种递质和肽类,而且还有递质与肽类或肽类与肽类在一个细胞中的共存。对视网膜神经递质、调质和神经肽的研究将是探索脑奥秘的有效途径。     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。     

肝干细胞的来源与作用

卵圆细胞(oval cells)是肝脏内体积小、细胞质清澈、核卵圆形、不易定性的细胞。它们可能来源于骨髓或与骨髓有关的细胞群,是活化形式的肝干细胞。肝干细胞的形态特征与卵圆细胞相似,生化标记为c-kit/CD~(45)/TER19。本文总结了人们对肝干细胞的认识和肝干细胞在肝脏发育、肝再生、肝癌发生中的作用及与其它细胞来源的联系。     

EGF促进小鼠卵母细胞体外减数分裂启动机制的研究

EGF和孕酮对小鼠卵母细胞减数分裂的重新启动具有促进作用,EGF的作用是通过促进颗粒细胞分泌孕酮实现的。使用孕酮合成关键酶3β-HSD的抑制剂Epostane可抑制EGF促进单层培养卵巢颗粒细胞的孕酮合成,从而降低EGF对卵母细胞的促进作用。Ca~(2 )参与了EGF和孕酮的促减数分裂重新启动作用。肝素可降低两者的作用。EGF和孕酮均可使单个卵丘颗粒细胞内的Ca~(2 )水平出现波动,并且EGF使卵丘细胞维持较高的Ca~(2 )水平。     

黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)精子的超微结构

黄颡鱼精子由头部、中段和鞭毛(尾部)三部分组成。头部的主要结构是细胞核。核中浓缩了的染色质呈颗粒状。染色质中有核泡存在。核泡中有致密颗粒状物。植入窝里井状,从核后端往前深陷入核的中央。中段的中心粒复合体位于植入窝中,结构独特。近端中心粒和基体首尾相对,排在同一直线上。某些精子的近端中心粒的中央腔中能见到一、二个粗大的颗粒状物。基体的中央腔中有一对中央微管。近端中心粒和基体之间有中心粒间体将两者隔开。中段的袖套连接于细胞核之后,其中分布着线粒体和一些囊泡。近袖套内膜处的细胞质中有一层膜与袖套内膜平行。鞭毛细长,其起始端位于袖套腔中。鞭毛上长有两排侧鳍。侧鳍呈波纹状,分居轴丝两侧,大致与轴丝的两条中央微管同在一个平面上。侧鳍的基部有囊泡。     

花背蟾蜍(Bufo raddei Strauch)眼形态发生过程中角膜上皮表面结构的扫描电镜观察

扫描电镜观察表明,花背蟾蜍眼形态发生过程中角膜上皮细胞表面形态结构的变化,大致可分三个阶段。1.从神经管期至肌肉感应期预定角膜上皮表面无明显变化;2.在心跳期和鳃血循环期预定角膜上皮表面出现较多的细胞缢束和其下细胞表面的下陷;3.在以后各期,角膜上皮中纤毛细胞的纤毛逐渐退化消失,在右鳃盖封闭期纤毛细胞全部消失。上述变化与视网膜及其中光感受器的发育分化密切相关,纤毛的退化和消失更精确地反映了这种依赖关系,似可作为角??膜上皮分化的一个形态指标。     

关于有尾类胚胎的表皮及非典型表皮的兴奋性

蝾螈胚胎表皮的兴奋性及传导能力在分期26出现,到分期37末结束,某些部位甚至更晚些消失。为了查明表皮细胞兴奋性的产生是否受到来自其它组织的影响,还是仅依赖于表皮细胞自身的分化状态,我们曾用非典型表皮进行过研究。当时曾报道,离体培养的表皮细胞,即使达到了产生兴奋性的分化状态,用电生理技术在刺激强度为1—2伏时,测试不到动作电位。然而,如果这样的非典型表皮被