简讯

青霉素酰化酶水解青霉素-G生产6-氨基青霉素烷酸(6-APA)我们从9个属234株细菌中筛选出19株产青霉素酰化酶的大肠杆菌,其中AS1.76和E110两株菌的酶活较强。通过培养条件试验,选出了两种适宜的培养基。一种是玉米浆-蔗糖培养基,另一种是鱼胨培养基,     

假丝酵母尿酸酶形成条件

选出了一株产尿酸酶的产朊候丝酵母(Candida utilis)AS2．117。此菌株尿酸酶形成条件的研究表明：尿酸、黄嘌呤和鸟嘌呤对酶形成起诱导作用;玉米浆对菌株生长和酶形成起十分重要的作用;蔗糖、葡萄塘、D-甘露糖和果糖是酶形成的适合碳源;生物素对酶产生有促进作用;在含有玉米浆培养基中加入无机氮源对产酶无作用,添加有机氮略增加产酶量。尿酸酶形成最适培养基组成为(％)：蔗糖;,玉米浆3,尿酸0．1,蛋白胨0．1,生物素0．05,KCI0．1,NaCl 0.1。最适pH为6．2。在250ml三角瓶中装30ml培养基为最适。在200r／min的旋转摇床上25℃振荡培养21h,在此条件下最终酶活力可达0．6u／ml。     

氨基苄青霉素酰化酶产生菌AS1.586产酶条件的研究

选出了一栋产氨基苄青霉素酰化酶的北京棒状杆菌(Corynebacteria pekinense) AS1.586,并对其产酶条件进行了研究。结果表明,最适培养基成份为(％)：L-谷氨酸钠0．2,酵母膏0.2,磷酸氢二钾0.3,氯化镁0.1,硫酸亚铁0.01,葡萄糖2,硫酸镉0.1,牛肉蛋白胨0.7,起始pH7.0,通气量在250ml 三角瓶中装30ml发酵培养基为最适,于28℃,180转／分的旋转摇床上振荡培养24小时,在此条件下最终酶活力可达5．4u／ml。     

大肠杆菌(Escherichia coli A S 1.357)L-天门冬酰胺酶的研究I. L-天门冬酰胺酶高产菌株的筛选

从87株细菌中筛选取得L-天门冬酰胺酶的高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.357)。采用7.5—10％玉米浆培养基(pH7.0一7.5),于37℃振荡培养8小时,可获得高活力的L一天门冬酰胺酶(4．6单位／毫升)。在我们的实验条件下,葡萄糖不利于L-天门酰胺酶的形成．     

尖镰孢胞外青霉素V酰化酶的产生

由腐殖土中分离出一株产胞外青霉素Ｖ酰化酶的尖镰孢（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）,编号ＦＰ９４１。研究了该菌在液体培养基中产胞外青霉素Ｖ酰化酶的条件。在以１０％麦麸为碳源的培养基中,添加氮源能促进酶的形成。无机氮源优于有机氮源。（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４的促进效果最佳,草酸铵次之,用量均为１％。为提高产酶量,培养基中添加诱导物是必要的、苯氧乙酸的诱导效果最佳,用量为０．１％,其次是青霉素Ｖ,用量为０．３％。最适培养条件为：培养     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达I．青霉素酰化酶基因的克隆

用EcoR I—Pst I双酶解的pBR322作为克隆载体,从大肠杆菌D816染色体克隆了青霉素酰化酶基因,这个基陶位于9．1Kb EcoRI片段上。所得克隆株整体细胞酶学特性与大肠杆菌D816一致,酶反应最适温度为55℃,最适pH为7．8—8．0。以青霉素G作为底物时Km为10．3mM,转化产物为6一氨基青霉烷酸。克隆株大肠杆菌c600(pPAl)合成青霉索酰化酶仍需苯乙酸诱导并被葡萄糖阻遏,细胞青霉素酰化酶的活性比大肠杆菌c P1(高2—4倍。     

固定化大肠杆菌AS1.76青霉素酰化酶的研究

用固定化青霉素酰化酶连续生产6-氨基青霉烷酸(简称6-APA)已有许多报道。近年来关于固定化微生物细胞的研究不断发展。Sato等曾用固定化的产青霉素酰化酶的细胞连续生产6-APA。我们用双功能试剂戊二醛固定化大肠杆菌AS 1.76的青霉素酰化酶,用来水解青霉素G生产6-APA。现将结果报告如下。     

脂肪酶产生菌Geofrichum sp. AS 2.1135产酶条件及酶一般性质的研究

在92株能同化油的地霉属菌株中,Geotrichum sp. AS2．1135菌株产脂肪酶活力为50—60u／ml,对其产酶条件的研究表明,不饱和长链脂肪酸和油类有利于酶的形成。在4％豆饼粉作为有机氮源的培养基中,加入0．2％尿素,酶活力显著增加,酶活达150u／ml。用聚乙二醇橄榄油乳化系统测定酶的作用最适pH为8．0,最适温度为4O一42℃。在pH4一9时5℃下存放24小时,或在pH 5和8时45℃保持15分钟,酶活力不变。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

刺孢小克银汉霉菌体氨基酰化酶的性质研究

首次选育出有较高氨基酰化酶活性的菌株刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata）9980,并进行液体培养,比较了3种不同培养基中菌体细胞氨基酰化酶活性,考察了几种因素对菌体细胞酶活的影响。结果表明：蛋白胨培养基中菌体细胞酶活最高,达680u／g。菌体细胞酶活最适温度55％,最适pH7．0,最佳底物浓度为0．2mol／L,缓冲液中的无机离子对酶活有抑制作用,10^-3-10^-4mol／L的Co^2＋对酶活有激活作用。     

纤维素酶水解糠醛渣生产酵母II．糠醛渣酶解液培养酵母

从82株不同种属酵母中选得3株酵母,它们能较好地利用纤维素酶水解糠醛渣所产生的糖液。其菌名和编号是假丝酵母(Candida sp.)As 2．121,热带假丝酵母(Candida tropicalis)培养基糖浓度以1．5％或2．0%较好,这与原始酶解液的糖浓度及其中糠醛等有毒物质有关。最好将原始酶解液稀释一倍以上使用。另外补加相当于含糖量7．5％的(NH4),SO4,5％的KH2PO4和2．5％的尿素。起始pH以5较好。三株菌的最适生长温度略有差异, AS2.121为28—32℃,AS 2.637为2 8—37℃,AS 2.1180为30—35℃,但最适生长温度范围均较广,在 生产上较易控制。在250毫升三角瓶中装培养基50毫升,接种酵母后在旋转摇床(170转／AS 2.121 菌株之菌体产率高且稳定,常达50％;AS 2．637菌株较耐高温,菌体产率亦可高达50％左右;AS 2．1180菌株在摇瓶培养条件下菌体产率较低,为40—45％,且较不稳定,可能和培养基pH值的控制有关。     

L-异白氨酸发酵的研究II．用糖质原料直接发酵生产L-异白氨酸

由钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum) AS 1.542经亚硝基脏诱变获得抗弘氨基a-氨基-β-羟基戊酸的突变株AS1.998,它的生长不再受外加的L-异白氨酸抑制。在含葡萄糖10％,硫酸铵4．0％,磷酸氢二钾0．1％,玉米浆0．75％,麸皮水解液0．5％,碳酸钙4.5%的培养基中,接种置2．5％,28℃振荡培养3天,L-异白氨酸的积累量达14毫克／毫升以上。用铜盐法制备的产品,经纸上层析,聚酰胺薄膜层析、比旋光度测定和生物鉴定,确证是L一异白氨酸。     

青霉素酰化酶高产菌株的快速筛选方法

采用青霉素梯度琼脂平皿筛选法,利用对青霉素G高抗性表型,专一筛选大肠杆菌青霉素酰化酶高产突变株。一次涂皿可淘汰绝大部分未突变株。我们从青霉素G梯度琼脂平皿上获得528株,从中得到32株产酰化酶活性高于出发菌株的正突变株,正突变率为6.06%,最高突变幅度为96.6%。     

大肠杆菌AE109青霉素G酰化酶的分离纯化及性质研究

 由发酵培养液所得大肠杆菌AE109菌体,先经高渗休克处理,继经D-苯甘氨酸-Sepharose 4B和DEAE-纤维素柱层析分离纯化得到青霉素G酰化酶,酶制品在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带,而且可以结晶。在SDS变性条件下解离为α和β两个亚基。 酶性质的研究结果表明,由大肠杆菌工程菌AE109菌株所得青霉素G酰化酶与其亲本大肠杆菌AS1.76菌株所得青霉素G酰化酶性质相同。     

青霉素酰化酶高产菌株的快速筛选方法

采用青霉素梯度琼脂平皿筛选法,利用对青霉素G高抗性表型,专一筛选大肠杆菌青毒素酰化酶高产突变株。一次涂皿可淘汰绝大部分未突变株。我们从青霉素G梯度琼脂平皿上获得528株,从中得到32株产酰化酶活性高于出发菌株的正突变株,正突变率为6.06%,最高突变幅度为96.6%。     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。     

细菌3-脱氧葡糖松还原酶产生面及产酶条件

从12株细菌菌株中筛选到一株产3-脱氧葡糖松还原酶的高产菌Bacillussp．2,并研究了该菌株的产酶条件。在所试验的细菌中,3-脱氧葡糖松氧化酶活性较低甚至检测不出,而还原酶活性普遍较高。该菌株最佳产酶条件为：培养基组成（％）：牛肉膏0．3,牛肉蛋白陈1．0,氯化钠0．5,0．5mmol／L3-脱氧葡糖松。培养基起始pH6．6,30℃振荡培养48h,产酶量最高,酶活力可达36．4u／g。3-脱氧葡糖松对产酶有诱导作用,而甲基乙二醛对产酶有抑制作用。     

产L-白氨酸突变株的选育及发酵条件的研究

钝齿棒状杆菌(Corysebacterium crenatum) AS 1.542经亚硝基胍连续诱变处理,选育出产大量L-白氨酸的突变株AS 1.1004。该菌以生物素为必需生长因子,酪蛋白水解物对生长有促进作用。当培养基中含生物素5—50徽克／升时,L-白氨酸的积累随生物素含量增加而提高;葡萄糖和醋酸铵是大量产生L-白氨酸的最适碳源和氯源。在含葡萄糖1 0％,硫酸铵2％,醋酸铵2％,KH2PO40．1％．MgSO47H2O 0.04％,FeSO4 7H2O2毫克／升,MnSO4 4H2O2毫克／升,生物素50微克／升,硫胺素·HCl 300欹克／升,蛋白胨0.3％,酵母膏0.3％,CaCO,2％,pH7.0的培养基中,于旋转式摇床上,28℃培养4天,产L-白氨酸14毫克／毫升以上。用强酸性阳离子交换树脂(H+型)提取的产品,经红外吸收光谱,薄层色谱,比旋光度,元素分析和生物测定法检定,证明该产品系L．白氨酸。     

聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶性质的研究

将巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）青霉素酞化酶连接到聚丙烯腈纤维载体上,制成固定化青霉素酰化酶。其表现活力约为2000u／g。水解青霉素G的最适温度为50℃;最适PH为9．0;在PHS．5～10．3、温度50℃以下酶的活力稳定;表观米氏常数Ka为1．33×10-8mol／L;最大反应速度Vm为2．564mmol·min-1;苯乙酸为竞争性抑制剂,抑制常数为0．16mol／L。水解10％的青霉素G钾盐溶液,使用20批,保留酶活力80％。