琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

R质粒对大肠杆菌L-天门冬酰胺酶活力的影响

对含有不同R质粒的6株大肠杆菌J53和不含质粒的大肠杆菌J53所产生的L-天门冬酰教酶的活力进行了比较,前者的L-天门冬酰胺酶活力比后者的降低了约1/2—3/4。消除大肠杆菌J53细胞中的R质粒后,L-天门冬酰胺酶活力明显增加并与不含质粒的大肠杆菌J53的相近。结果表明,在大肠杆菌内存在的R质粒对寄主的L-天门冬酰胺酶活力具有明显的抑制作用。     

大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶的选择性化学修饰

用九种化学修饰剂研究了大肠杆菌AS1.357 L-天门冬酰胺酶分子中的五种不同氨基酸侧链基团与催化活性的关系。结果说明,渡酶活力与硫氧墓完全无关;与色氨酸、精氨酸和组氨酸亦无直接联系;而酪氨酸残基和羧基的修饰引起酶活力急剧下降。其中酪氢酸残基巳被证实是该酶活力的必需基团,处于该酶分子的活性部位。     

琥珀酸弧菌L天门冬酰胺酶高纯度lgG的制备和应用

本文报道琥珀酸弧苗L-天门冬酰胺酶高纯度IgG的制备,采用溴化氰活化的琼脂糖球珠亲和层析,将IgG中能与受体大肠杆菌结合的组分除去,使该IgG在应用于基因工程筛选中降低本底,重复性好,提高筛选效率。将其用作放射免疫探针和酶联免疫探针,在筛选L-天门冬酰胺酶基因的正克隆中有其独到的优越性。     

用盐酸胍和Triton X-100从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

研究了用盐酸胍和TritonX 10 0处理ATCCEscherichiacoli 1130 3细胞 ,使细胞内的L-天门冬酰胺酶 (EC 3.5 .1.1)释放到细胞外的方法 ,发现盐酸胍和TritonX 10 0结合使用的效果好。考察了盐酸胍浓度、TritonX 10 0浓度、大肠杆菌细胞浓度、处理时间、pH值等因素对L -天门冬酰胺酶释放的影响。结果表明 ,0 .75～ 1mol/L盐酸胍、2 %TritonX 10 0、细胞浓度 3.2× 10 8/ml、pH 7.0、15℃处理 16～ 2 0h后 ,酶的释放率达到 6 0 %左右。这种方法操作简便 ,酶的释放率较高 ,但对酶无明显的选择性。     

大肠杆菌L-天门冬酰胺酶的研究II．大肠杆菌AS 1.357 L-天门冬酰胺酶的提纯和性质

用硫酸铵盐折,酒精分级沉淀,酸处理和DEAE纤维素层析等方法,从大肠杆菌AS 1．357的无细胞提取液中提纯L天门冬酰胺酶近90倍,比活力达200单位／毫克蛋白质以上,总收率约18％。用葡聚糖凝赕G-100凝胶过滤法测定分子量约为144500,用等电点聚焦电泳测定等电点为pH4.6,最适反应pH和温度分别为7．0和55℃左右,酶的紫外吸收光谱最大吸收值在水溶液中为278毫微米,在0．1NNaOH溶液中为290毫微米,提纯各段均不含无抗癌活力的EC一1组份。酶的冷冻干燥制品在低温下保存一年未见任何酶活力损失。     

廉价制造L-天门冬氨酸

日本三菱石化公司已用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵法生产L-天门冬 。     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅱ.比较家蚕和野蚕谷氨酰胺酶及天门冬酰胺酶,蓖麻蚕丝腺体中天门冬酰胺酶之提取及其性质之研究

(1)比較家蚕(华九-云瀚)和野蚕(萞麻蚕、柞蚕和樗蚕)之谷氨酰胺酶及天門冬酰胺酶之活力,发現在萞麻蚕絲腺体后部之細胞顆粒部分中,存在有活力甚強之天門冬酰胺酶。(2)自萞麻蚕絲腺体后部提取之天門冬酰胺酶制品中,不含有谷丙轉氨酶、谷天轉氨酶及谷氨酰胺酶。(3)L-天門冬酰胺之酶促水解作用在1小时过程中,活力和作用时間基本土表現直线关系。(4)萞麻蚕絲腺体后部之天門冬酰胺酶和哺乳类动物、植物及微生物之pH影响相同;在pH5以下不稳定,最适pH为8。(5)天門冬酰胺酶对热不稳定,先以不同温度和酶溶液作用10分钟,60℃时,活力丧失80%左右。(6)对氯汞苯甲酸(10~(-4)M)抑制天門冬酰胺酶20%,溴化乙酰胺(10~(-3)M)及DL-环絲氨酸(10~(-3)M)抑制15%。     

E.ColiA.S1.588生产L—天门冬酰胺酶发酵工艺的研究

Ｅ·ＣｏｌｉＡ·Ｓ１．５８８生产Ｌ－天门冬酰胺酶发酵工艺的研究陈丽媛,金守满,刘薇,陆春左,元福实（辽宁省微生物研究所,朝阳１２２０００）Ｌ一天门冬酰胺酶（ＥＣ３．５．１．１）即Ｌ一天门冬酰胺酰胺基水解酶,专一催化Ｌ一天门冬酰胺水解形成Ｌ一天门冬氨酸...     

天门冬酰胺对赤霉酸促进枯草杆菌A_(17)α-淀粉酶形成的阻抑作用

天门冬酰胺能够阻抑GA_3、ATP和环-AMP促进枯草杆菌A_(17)α-淀粉酶的合成。这种天门冬酰胺阻抑效应是影响细菌α-淀粉酶的合成,而不是抑制α-淀粉酶的活力。对天门冬酰胺的阻抑效应本质尚未清楚,文中作了一些讨论。     

天门冬酰胺对赤霉酸促进枯草杆菌A_(17)α-淀粉酶形成的阻抑作用

天门冬酰胺能够阻抑GA_3、ATP和环-AMP促进枯草杆菌A_(17)α-淀粉酶的合成。这种天门冬酰胺阻抑效应是影响细菌α-淀粉酶的合成,而不是抑制α-淀粉酶的活力。对天门冬酰胺的阻抑效应本质尚未清楚,文中作了一些讨论。     

L—天门冬氨酰胺一水合物的合成

<正> L-天门冬氨酰胺是构成蛋白质的一种氨基酸成分。因此是一种重要的生化试剂。在医药上,它是氨基酸输液(20种氨基酸)的一个组分。目前,国内只报导了用抽提法生产L-天门冬氨酰胺的工艺,由于原料来源有限,生产量满足不了市场上的需要。而在国外则主要以化学合成法生产L-天门冬氨酰胺。如日本就是采用化学合成法,由L-天     

蚕氨基酸代谢之研究 Ⅲ.丝腺体L-天门冬氨酸及α-酮戊二酸形成丙氢酸之机制

研究了家蚕(Bombyx mori L.),天蚕蛾科之蓖麻蚕(Philosama cynthia ricini B.)及柞蚕(Antheraea pernyi G.)丝腺体后部自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸的机制。以上各种蚕的丝腺体组织都可利用L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成丙氨酸,谷氨酸及CO_2。当存在DL-环丝氨酸(10~(-4)M)时,形成较多的谷氨酸与丙酮酸,而丙氨酸之量显著地减少。以L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸或以L-谷氨酸与丙酮酸为底物,对丙氨酸之形成具有相同的抑制程度。DL-环丝氨酸(10~(-4))并不抑制谷-天转氨酶与草酰乙酸脱羧酶,但在同样条件下,可显著抑制谷-丙转氨酶的活力(～90%)。此外,若以L-天门冬氨酸或其与小量α-酮戊二酸为底物,尤其是用透析后之酶液,并无显著的丙氨酸与CO_2形成。我们认为,自L-天门冬氨酸与α-酮戊二酸形成之丙氨酸,并非通过Bheemeswar提出的L-天门冬氨酸β-脱羧酶之作用,而是经过三个相继的反应,即在谷-天转氨酶催化下,形成谷氨酸与草酰乙酸,后者除非酶促分解外,在草酰乙酸脱羧酶作用下,形成丙酮酸与CO_2;由以上两反应所形成之谷氨酸与丙酮酸,在蚕丝腺普遍存在的谷-丙转氨酶催化下形成丙氨酸(见图8)。     

利用谷氨酸生产菌转化生产L-天门冬氨酸

L-天门冬氨酸在生理代谢上具有重要作用,是高血氨症、心肌功能障碍、脑神经机能亢进和肝脏系统疾病的有效治疗药物,又可作为合成高效无毒甜味剂的原料。利用微生物生产L-天门冬氨酸的方法较多,近几年来又有关于     

用明胶-戊二醛法固定大肠杆菌细胞生产L-天门冬氨酸

我们选用大肠杆菌(Escherichia coli)AS1.881菌株,制备固定化大肠杆菌细胞,用于连续生产L-天门冬氨酸,现报道如下。材料和方法一、材料明胶为瑞士Fluka AG公司产品和上海明胶厂照相用明胶。二者无差别。戊二醛为E.     

天门冬离体快繁技术

以无菌萌发的天门冬(Asparagus cochinchinensis)种子胚轴为外植体,研究植物生长调节物质种类及浓度对愈伤组织诱导、丛生芽分化和植株再生的影响,建立其离体快速繁殖技术。结果表明,愈伤组织诱导的适宜培养基为MS + 6-BA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1,诱导率95.6;愈伤组织增殖培养基为MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 2.0 mg·L-1,增殖倍数为9.7;丛生芽诱导培养基为MS + 6-BA 0.5 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1 + KT 0.1 mg·L-1,诱导率为91.1;适宜的壮苗培养基为MS + 6-BA 0.2 mg·L-1 + IAA 1.0 mg·L-1;适宜的生根培养基为1/2MS + NAA 2.0 mg·L-1,生根率达84.4。本研究为构建天门冬药材产业化所需种苗生产技术体系奠定了基础。     

用双水相系统从大肠杆菌细胞内释放L-天门冬酰胺酶

聚乙二醇－磷酸盐双水相系统可以释放大肠杆菌ＡＴＣＣ１１３０３细胞内的Ｌ－天门冬酰胺酶。研究了聚乙二醇、磷酸氢二钾的浓度对酶和蛋白质的释放及分配的影响。在双水相系统中加入适量的盐酸胍和ＴｒｉｔｏｎＸ１００可以提高酶的释放量。实验表明,用新的下相代替富含酶的下相,上相能够重复使用几次。这种方法将酶的释放和萃取结合为一个步骤,使酶的纯化更加简单和有效     

重组L-门冬酰胺酶工程菌的表达和PEG的化学修饰

目的提高重组L-门冬酰胺酶(rL-ASP)工程菌的表达量,分离纯化rL-ASP并对之进行PEG化学修饰。方法将带有编码rL-ASP的基因的质粒(pKA)导入不同的宿主菌中,挑出高表达菌株,同时优化发酵培养基,分离纯化获得的高纯度rL-ASP再用PEG进行化学修饰,SDS-PAGE检测修饰效果。结果在pH7.0的条件下,宿主菌为JMl09的工程菌pKA/JMl09酶活力最高,三角瓶振摇培养的酶活力可达216×103IU/L;发酵罐发酵培养,酶活力达312×103IU/L。纯化后的rL-ASP比活力为220IU/mg,rL-ASP经过PEG化学修饰生成rL-ASP-PEG,分子量发生改变。结论改变目标蛋白表达的宿主菌和优化发酵工艺,提高了rL-ASP的表达量,纯化的rL-ASP经过PEG化学修饰后分子量增大。     

保鲜剂对天门冬切叶的保鲜效应

以150 mg·L-1柠檬酸+500 mg·L-1 CaCl2+1 mg·L-1 6-BA为基础液，加入不同浓度蔗糖和青霉素进行瓶插试验，研究天门冬(Asparagus cochinchinensis)切叶瓶插寿命、黄化程度及生理变化。结果表明，基础液添加100 mg·L-1青霉素+0.25%蔗糖保鲜液对天门冬切叶保鲜效果最好，与对照比，瓶插寿命延长11.3 d；比对照推迟4 d出现黄化现象；叶绿素含量推迟3 d达到峰值；鲜重变化率比对照推迟2 d达到峰值，且维持在较高水平；相对电导率和MDA维持较低水平；POD活性推迟3 d出现峰值，且POD活性比对照高，CAT活性推迟6 d出现峰值，且CAT活性维持较高水平。说明适宜浓度的蔗糖和青霉素能减缓叶绿素含量和叶片鲜重下降，抑制叶片内膜脂过氧化产物MDA产生，维持叶片膜结构相对稳定，增强POD和CAT活性，保持天门冬切叶观赏品质并延长瓶插寿命。     

α-天门冬氨酰二肽酶及其进化酶的FT-IR研究

用分子定向进化技术,在酶活力和热稳定性双重选择压力下,筛选到了一株Kcat/KM是天然酶47倍的进化酶.用FT-IR方法,测定了α-天门冬氨酰二肽酶及其进化酶的酰胺I带图谱,定量估算了天然酶和进化酶的各种二级结构含量.天然酶中,β折叠结构含量为28.5%,α螺旋结构含量为33%,这与园二色谱测量α螺旋结构为33%的结果有很好的一致,剩余的残基形成不同类型的转角和无规结构,其总含量为38.5%.在进化酶中,β折叠结构含量为26.8%,α螺旋结构含量为31%,其它结构为不同类型的转角和无规结构,含量为42.2%.