L-异白氨酸发酵的研究——Ⅲ.糖质原料直接发酵生产L-异白氨酸

前文报道了AS 1.998直接发酵生产L-异白氨酸的试验。本文总结了利用AS 1.998菌以糖质原料发酵生产L-异白氨酸扩大试验的结果,现报告如下。     

产L-白氨酸突变株的选育及发酵条件的研究

钝齿棒状杆菌(Corysebacterium crenatum) AS 1.542经亚硝基胍连续诱变处理,选育出产大量L-白氨酸的突变株AS 1.1004。该菌以生物素为必需生长因子,酪蛋白水解物对生长有促进作用。当培养基中含生物素5—50徽克／升时,L-白氨酸的积累随生物素含量增加而提高;葡萄糖和醋酸铵是大量产生L-白氨酸的最适碳源和氯源。在含葡萄糖1 0％,硫酸铵2％,醋酸铵2％,KH2PO40．1％．MgSO47H2O 0.04％,FeSO4 7H2O2毫克／升,MnSO4 4H2O2毫克／升,生物素50微克／升,硫胺素·HCl 300欹克／升,蛋白胨0.3％,酵母膏0.3％,CaCO,2％,pH7.0的培养基中,于旋转式摇床上,28℃培养4天,产L-白氨酸14毫克／毫升以上。用强酸性阳离子交换树脂(H+型)提取的产品,经红外吸收光谱,薄层色谱,比旋光度,元素分析和生物测定法检定,证明该产品系L．白氨酸。     

L-正白氨酸的立体控制合成

本文报导了立体控制合成 L-正白氨酸的新方法。由“+”-2—羟基蒎烷-3-酮与(-)—甘氨酸(艹孟)脂缩合,而得双不对称诱导体系。在-78℃下与碘代正丁烷反应,水解,得到 L-正白氨酸,e、e 值高达96%。该体系在0℃下反应,所得的正白氨酸,e、e 值达91%。     

L-异白氨酸发酵的研究IV．L-异白氨酸生物合成调节机制的初步研究

钝齿棒状杆菌新种AS 1．542,及其诱变株AS 1.998均含有Tdase、AHAase及Taase活性。试验了二价离子及pH对酶活性的影响。测定了Tdase及AHAase受末端氨基酸反馈抑制的程度,及表观米氏常数。结果表明,Tdase及AHAasc均有两个酶反应最适pH。Leu、Ileu、Val及KB对酶活性均有负反馈抑制作用。AS 1.998的Tdasc受Ileu、Val的负反馈抑制作用减少;其AHAase总活性明显增加。由此认为诱变株AS 1.998受到的末端氨基酸反馈控制作用被部份解除,从而导致该菌积累Jleu．     

微生物酶法合成L-半胱氨酸和L-胱氨酸

从土壤中分离到一株假单胞菌Pseudomonas sp.TS1138菌株,其胞内含有DL-2-氨基-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-Amino-Δ²-Thiazoling-4-Carboxylic Acid,缩写为DL-ATC)水解酶,以培养16h的细胞为酶源,可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。该菌株生长及产酶的最佳碳、氮源为葡萄糖和尿素,DL-ATC对酶的产生具有诱导作用。酶促反应后的产物经薄层层析、旋光度法和高效液相色谱鉴定为L-半胱氨酸。     

产碱菌(Alcaligenes sp．)119转化苯丙酮酸形成L-苯丙氨酸的研究

从土壤中分离到一株产碱菌(Alcaligenes sp)119．能将苯丙酮酸一步转化成L-苯内氨酸。酶反应的最适pH为8 5．该酶在pH8 9之间稳定．最适反应温度为37-15℃．金属离子Fe2+、Mn2+等对酶有不同程度的抑制作用,该菌株培养在由葡萄糖、蛋白胨,牛肉膏等组成的培养基中,可获得最高转化率L-天冬氨酸为酶反应的最佳氨基供体。当苯丙酮酸浓度为0.2mol／L时,细胞在37℃下反应16小时．可产L-苯内氨酸30.lg/L．其克分丁转化率为92.7% 采用离子交换树脂分离提纯产物．总收率在69％以上。产物经熔点、比旋光度、元素分析、红外光谱及纸上层析鉴定．证实是L-苯丙氨酸。     

L-亮氨酸发酵的研究

钝齿棒状杆菌(Corynebacterlum crenatum)L-421是一株能产大量亮氨酸的突变株,它是从Corynebacterium crenatum AS1.1004菌株经NTG和快中子处理后获得的突变株。在含有葡萄糖、硫酸铵和尿素的培养基中,在2000升罐上,30℃发酵40小时,产亮氨酸可达20g/L。经强酸型阳离子交换树膳提取,收率可达40%以上,并得到符合美国药典85年21版标准的精品。发酵提取工艺简单,适于工业化生产。     

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-?2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-?2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)为底物原料, 经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸, 并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究。建立了以恶臭假单胞菌TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源, 反复多次催化底物合成L-半胱氨酸, 并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸, 进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺。采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%, 纯度为99.12%。该方法简单高效, 解决了酶稳定性差不能重复使用, 而固定化酶方法繁琐成本高的问题, 为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。     

利用固定化酵母细胞转化反式肉桂酸生产L-苯丙氨酸

研究了探红酵母(Rhodotorula rubra)的培养基成分、培养固定化及转化条件。实验表明最佳培养基成分(％)：葡萄糖0 5,胰蛋白胨0．5,酵母膏0．5,磷酸二氢钾0．05,L-Phe0．05,pH．0,30℃,20L发酵罐中培养15～17h.最佳固定化条件为：用2．5％卡拉胶包埋18％的湿菌体。最佳转化条件为：1．0％反式肉桂酸,4mol／L铵离子,pH10．5,30℃。用卡拉胶固定化的深红酵母(Rhodotorula rubra)可以将77．7％的反式肉桂酸转化为L-苯丙氪酸。     

L-缬氨酸生物合成调节机制的初步研究

比较了钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542及其积累缬氨酸的诱变株AS1.1001的L-苏氨酸脱氨酶(TDase)与α-乙酰羟酸合成酶(AHASase)活性,及受各种氨基酸反馈抑制的程度。AS1.1001菌TDase对苏氨酸的K_m值为4.5mM,AHASase对丙酮酸的K_m值为3.4mM。缬氨酸、异白氨酸及丁酮酸对AHASase表现出竞争性抑制,其K_i值依次为0.39、0.52及2.37mM。TDase的Hill系数随苏氨酸浓度增加,从1.2升至3.2。AHASase的Hill系数则为1.2左右。认为TDase活性降低,AHASase活性增加,缬氨酸与异白氨酸的反馈抑制程度减轻,导致了缬氨酸的过量累积。据此初步探讨了缬氨酸生物合成途径及调节机制。     

乳糖发酵短杆菌L－氨酸产生菌的选育

从谷氨酸产生菌Brevibacterium lactofermentum XQ5121出发选育L-苏氨酸产生菌。以硫酸二乙酯(Des)和甲基磺酸乙酯(Ems)诱变处理,用α-氨基-β-羟基戊酸(Ahv)和s－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(Aec)药物平板及琥珀酸培养基(Sam)平板定向筛选,最后获得一株L－苏氨酸高产菌Zt－1株(AHV^г AEC^г SAM^g),可在适宜的培养条件下积累16mg／m1 L－苏氨酸。试验结果表明,在以琥珀酸为唯一碳源的平板培养基(sAM)上生长迅速即sAM 变异可导致L－苏氨酸积累大幅度提高。 文中对B.lactofermentum L-苏氨酸产生菌的选育机理作了讨论。     

L-脯氨酸发酵研究

本文报道北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense) AS 1.299鸟氨酸缺陷型突变株 AS1.727发酵产生L-脯氨酸的研究结果。培养基中需亚适量的精氢酸、80-100μg／l的生物素和高浓度的铵离子。氮源以氯化铵最优,硫酸铵次之．实验表明氯离子有利于产生L-脯氨酸,镁离子也有促进作用。在本实验所 使用的培养基中,30℃培养5天,产L-脯氨要达25mg／ml以上。用生成特殊的、难溶于水的五氯酚脯氨酸复合物,结合离子交换法和溶媒抽提法等分离技术,提取产品。经熔点、元素分析、比旋光度、红外光谱分析及纸上色谱分析,证明产物确是L-脯氨酸。     

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid,DL-ATC)为底物原料,经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸,并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究.建立了以恶臭假单胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS1138)全细胞为酶源,反复多次催化底物合成L-半胱氨酸,并以2.0%二甲基亚砜(DMSO)为氧化剂氧化生成L-胱氨酸,进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺.采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78.55%,纯度为99.12%.该方法简单高效,解决了酶稳定性差不能重复使用,而固定化酶方法繁琐成本高的问题,为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径.     

L-乳酸发酵的研究

本文报导了L-乳酸产生菌筛选、发酵条件以及发酵产物鉴定的结果。从56株根霉中筛选出10株产L-乳酸较高的菌株,其中根霉R47产L-乳酸最高,产酸稳定。发酵条件试验结果表明,该菌最适发酵培养基组成(％)：葡萄糖15,尿素0．2,KH 2PO40．02,MgSO4·7H2O0．025,ZnSO4·7H2 0 0．0044,CaCO3,6,7;pH6．7。在摇瓶培养条件下,35℃48小时,产L-乳酸达11．84 g／100 ml,对糖的重量转化率达78,9％。发酵液经离子交换等方法纯化,得到无色或微黄色透明糖浆状液体。经纸层析、比旋光度测定、紫外光谱和红外光谱分析证明确系L-乳酸。     

L-茶氨酸新型酶法制备及其催化工艺优化

L-茶氨酸是茶叶中游离氨基酸的主要组成部分,关于其良好的生理活性已有广泛报道。首次报道了来源于Cunnighamella echinulata 9980的L-氨基酰化酶用于高光学纯度的L-茶氨酸的酶法制备。该酶在pH 6.5,底物N-乙酰-DL-茶氨酸浓度为50 mM,且有40 mM CoCl2时催化效果较好。结果表明,在上述条件下,50℃作用12 h得L-茶氨酸22.5 mM,转化率90%。     

利用重组钝齿棒杆菌高效合成L-茶氨酸

【目的】构建Bacillus subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶蛋白(GGT)的Corynebacterium glutamicum SYPA5-5表达系统,验证该蛋白信号肽片段在宿主表达体系中的作用,并将该体系应用于高效合成茶氨酸的研究。【方法】将该ggt基因和切除信号肽的片段基因(?sp ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中克隆表达。以C.glutamicum SYPA5-5高产L-精氨酸培养基为基础进行重组菌产酶优化。最优转化条件为:L-谷氨酰胺∶乙胺为1∶3,酶量为0.06 U/mL。采用底物流加策略高产L-茶氨酸,40 mL的转化体系包含:终浓度为0.9 U/mL的GGT,pH 10,37℃,从0 h开始每隔2 h补加20 mmol/L的L-谷氨酰胺,60 mmol/L的乙胺。【结果】C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-ggt发酵上清液中GGT酶活达到(4.69±0.34)U/mL,C.glutamicum SYPA5-5/pXMJ19-?sp ggt只检测到胞内酶活(0.99±0.17)U/mL,说明利用B.subtilis来源的信号肽可以实现GGT在C.glutamicum体系中分泌表达。最适产酶培养基条件为:葡萄糖浓度为10%;IPTG最适添加时间为0 h。批次流加在12 h时达到最大茶氨酸产量104.36 mmol/L,转化率为86.9%。【讨论】本文首次实现B.subtilis来源的γ-谷氨酰转肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SYPA5-5中分泌表达,通过分批流加底物获得目前报道的利用重组C.glutamicum合成L-茶氨酸的最高产量。     

大肠杆菌(Escherichia coli A S 1.357)L-天门冬酰胺酶的研究I. L-天门冬酰胺酶高产菌株的筛选

从87株细菌中筛选取得L-天门冬酰胺酶的高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.357)。采用7.5—10％玉米浆培养基(pH7.0一7.5),于37℃振荡培养8小时,可获得高活力的L一天门冬酰胺酶(4．6单位／毫升)。在我们的实验条件下,葡萄糖不利于L-天门酰胺酶的形成．     

双菌深层发酵纸浆纤维产生单细胞蛋白及5’-单核苷酸的研究

产黄纤维单胞杆菌(Cellulomonas flavigena 372—24D)和腐臭假单胞杆菌(Pseudomonaspuelda 372-24M)可利异纸浆(含73．7％纤维素)作唯一碳源进行混合发酵。经过五天振荡培养,纸浆纤维素分解98％。每消耗一克纸浆可产生0．17克菌体蛋白质。氨基酸组份分析表明,此种蛋白质中含5．4％赖氨酸、7．5％精氨酸、9．1％亮氨酸和8．4％缬氨酸等。将发酵液pH调至10,60℃保温20分钟,菌体内核糖核酸(RNA)含量减少一半左右,RNA降解成单核苷酸。发酵液经过纯化可获得四种单核苷酸结晶。经纸层析、纸电泳和紫外吸收光谱鉴定,它们分别为5-腺苷酸(5’AMP)、5-尿苷酸(5’-UMP)、5’-胞苷酸(5’-CMP)和5'-鸟苷酸(5’-GMP)。本文并对双蓖纤维素发酵过程的生理生化变化进行了研究。     

色氨酸发酵的初步研究

我们从271株酵母菌中,选出一株可利用邻氨基苯甲酸为前体产生色氨酸的优良菌株——阿保利假丝酵母(Candida arborea AS 2．566)。对该菌的发酵条件进行了初步研究,发现通气量、邻氨基苯甲酸浓度等与色氨酸产量有密切关系。采用乙醇一邻氨基苯甲酸混合分次追加的方式,可提高色氨酸的产量。用30升发酵罐试验,色氨酸产量达5克／升以上。     

L-精氨酸发酵条件的研究

本文报道了产L一精氨酸突变株(Corynebacterium crenatum)971．1(SG,His-)摇瓶发酵条件的研究结果。试验结果表明,培养基中组氨酸与生物素的适宜用量有助于产物的生成,组氨酸或豆饼水解物用量分别为50~g／’ml和o．{％、生物素或玉米浆用量分别为7 5—125 pg／L和2．0％时,可得到较高产酸率。为获得较高的精氨酸积累量,培养基中初糖浓度为12％,硫l酸铵用量应高达6．5％为适宜,如减少摇瓶装液量以改善通风状况可明显提高产酸率。在适宜的发酵条件下,971．1菌株经发酵培养96小时,产酸最高可达到3{mg／mlo发酵液经732型离子交换树脂提取后,获得纯品结晶。该结晶经生物鉴定、比旋度测定以及c、H、N元素含量分析,其结果均与文献值相符;红外光谱分析与标准样品一致;纸层析图谱表明,50pg样品层析显色后为单斑点,其＆值与标准品相同;从而证明所得纯品结晶是L一精氨酸。