随机序列八肽库的构建及其在双杂交系统中的应用

目的:构建一个随机序列八肽库并从中寻找非天然的具有药用价值的多肽。方法:利用基因工程技术构建随机序列八肽库,首先设计并合成了含8个密码子的随机寡核苷酸链,摸索了变性温度与时间、复性温度与时间、延伸温度与时间以及循环数后利用PCR扩增了这一片段,并解决了片段回收、连接等步骤,最后比较了不同的转化方法,采用最简便高效的TSS法转化大肠杆菌建立了随机序列八肽库。结果:利用作者所建立的随机序列八肽库应用于酵母双杂交系统并从中筛选到了一段感兴趣的多肽。结论:随机序列八肽库构建成功并且具有应用价值。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组经Sau3AI不完全酶切,回收3~9 kb DNA酶切片段,用T4连接酶将回收片段按一定比例与经BamHI酶切、南极热敏磷酸酶去磷酸化处理后的pUC18质粒载体连接,热激法转化受体菌E.coliDH5α,在含有IPTG/X-gal和Amp 的LB平板上筛选重组子,所得克隆数为9×103个,以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7 Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99%的基因组,达到了建库要求的理论值。随机挑取白色菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建,为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合,从而将随机短短肽表达于噬菌体的表面,将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体,构建了噬菌体短肽库,证明其库容为２×１０＾７集落形成单位,重组率为９３％。     

利用噬菌体展示技术构建Mhp168株Hsp70随机肽库

[目的]构建Mhp168株Hsp70 C端基因的噬菌体展示随机肽库。[方法]扩增猪肺炎支原体168株热休克蛋白Hsp70 C端1 803 bp的DNA序列。回收Hsp70 DNaseⅠ消化产物中80～150 bp的DNA片段与p C89载体连接。辅助噬菌体超感染转化重组噬粒的E.coli XL1-Blue细胞。检测肽库的多样性,测定库容。[结果]在噬菌体表面展示出Hsp70 C端基因的随机片段融合蛋白。随机肽库库容约为9.9×10~3,滴度约为1.5×10~(13)PFU/ml。[结论]所构建的随机肽库可以满足Hsp70构象型抗原表位筛选。     

人造抗瘤活性肽的构建及其抗瘤作用

通过构建融合RGD肽的NF-κB抑制肽,获取新型抗瘤融合肽,研究其抗肿瘤效果。构建人造抗瘤活性肽p EGFP-C1-ARP表达载体,转染COS7细胞,获取人造抗瘤活性肽,利用Western blotting法检测PC-3M细胞A20、Bcl2、CCND1;通过观察ARP对荷人前列腺癌PC-3M裸鼠肿瘤抑制实验,研究人造抗瘤活性肽的抗肿瘤效果。限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成人造抗瘤活性肽真核载体寡核苷酸链插入正确。Western blotting检测结果表明转染后PC-3M细胞A20蛋白表达增加。并抑制凋亡抑制基因Bcl2的表达,动物实验证实人造抗瘤活性肽可显著抑制肿瘤生长。本研究成功构建人造抗瘤活性肽,其对肿瘤细胞具有明显的消除效应。     

噬菌体6肽随机表面表达文库的构建

体外合成编码６肽的随机ＤＮＡ片段以及用于随机ＤＮＡ片段扩增了一对ＰＣＲ引物,再经ＰＣＲ扩增,ＢｇＩＩ酶切扩增产物,获得编码６肽的随机ＤＮＡ克隆片段,并利用已构建的噬菌体表面表达载体,经抗性和插入复活筛选,获得１．６×１０＾８个独立克隆,构成库的克隆经酶切,ＰＣＲ扩增,斑点杂交,序列测定,亲和素富集等方法的综合鉴定和评定,以及６肽随机克隆体外增殖和表达特性观察,结果均表明,我们成功构建了编码６肽的     

分子克隆中使用的其他酶(续)

核酸酶BaJ31: 此酶有以下两种活性:(1)高度专一的单链脱氧核糖核苷酸内切酶与外切酶活性,催化从双链DNA3′,5′两端切除寡核苷酸片段或单核苷酸的反应(DNA两条链的降解速度几乎是相同的)。(2)与核酸酶S_1相似的单链专一内切酶活性。     

利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌Ⅳ型纤毛结合的细胞受体

伤寒杆菌病原毒力岛上的Ⅳ型纤毛与伤寒杆菌的致病性密切相关,但对Ⅳ型纤毛在人巨噬细胞、树突状细胞上的受体及其序列或结合的关键部位还一无所知。本研究拟用核糖体展示库筛选伤寒杆菌结合的细胞受体。体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA库,随后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体库。利用含随机12肽的核糖体库与体外重组表达的Ⅳ型纤毛结构蛋白(PilS蛋白)进行了初步筛选,为筛选到与伤寒杆菌毒力岛上Ⅳ型纤毛结构蛋白结合的细胞受体奠定了基础。     

淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的构建及鉴定

提取淀粉酶链霉菌SM33基因组DNA,用Hind III部分酶解后回收40 kb～60 kb大小的高分子量DNA,与质粒载体pIndigoBAC536连接,电击转化EPI300感受态细胞,经蓝白斑筛选共挑取了5 184个白色克隆.从文库中随机挑选10个克隆,酶切检测平均插入片段约为50 kb,覆盖了32.4倍基因组.并且插入片段均具有9～15个Not I酶切位点,符合链霉菌基因组特征.通过对BAC文库的筛选,获得苹果酸脱氢酶基因(mdh)的保守序列,与已知的链霉菌mdh具有很高的相似性.淀粉酶链霉菌BAC基因组文库的建立,对基因克隆、基因组物理图谱、次级代谢途径、新抗生素的发现以及工业用酶的应用等研究均有重要意义.     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

随机十肽库的构建及血管形成素结合肽的筛选

将合成的含有随机序列（NNK）₁₀的寡核苷酸片段,克隆入噬菌体呈现载体噬菌粒pCANTAB5E的SfiⅠ,NotⅠ位点,即cpⅢ蛋白信号肽与成熟肽之间,电转化E.coli TG1,构建了噬菌体表面呈现的十肽库,实际库容为3.53×10⁷,插入率为66.7%.经辅助噬菌体M13KO7超感染后,获得滴度为4.8 ×10¹¹ pfu/ml的噬菌体上清.经过两轮panning筛选和富集,从构建的随机十肽库中筛选到26个具有血管形成素结合活性的重组噬菌体克隆,对其中12个阳性噬菌体克隆的短肽序列进行了分析,ELISA检测结果显示12个阳性噬菌体克隆都能够与血管形成素特异性结合.     

噬菌体短肽库的构建及其随机短肽的多样性

噬菌体短肽库是将随机合成的寡核苷酸序列通过与单链噬菌体外壳蛋白基因融合,从而将随机短肽表达于噬菌体的表面。将体外随机化学合成的寡聚核苷酸序列重组到单价噬菌体表达载体,构建了噬菌体短肽库,证明其库容为２×１０￣７集落形成单位（ｃｆｕ）,重组率为９３％。同时将１１个随机克隆进行序列测定,证实其寡聚核苷酸序列和氨基酸的分布几乎是完全随机的,其多样性可以满足特异性短肽筛选的要求。     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料,提取基因组DNA,经Sau 3A Ⅰ部分酶切后回收35-40 kb之间的片段,连接到pCC1FOS载体上,经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库,文库的滴度为8.8×105CFU/mL.随机挑取16个阳性克隆,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切电泳分析,样品插入片段平均长度大于35 kb,插入率为100%,符合构建文库的要求.根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因(PKS)设计特异性引物,以基因组为模板进行PCR扩增,筛选特异性引物探针.结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1 693 bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95%以上.武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得,为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础.     

香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交eDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BD SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit User Manual cDNA合成试剂盒,反转录合成带有目的接头cDNA第一链,通过LD-PCR,扩增双链cDNA(ds cDNA).产物经双酶切后回收,与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化,并进行了鉴定.结果表明:提取的RAN的A260/A280=1.82,表明所提RNA纯度高:双链cDNA文库大于0.2 kb,且弥散较长,成瀑布条带状;根据生长菌落计数,文库含有1.2×106转化子,重组子不同插入片段在0.3～2 kb之间.表明该文库达到建库要求,为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础.此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道.     

汉坦病毒糖蛋白G1酵母双杂交诱饵载体的构建及初步鉴定

拟利用Ras募集系统(RRS)构建并鉴定含汉坦病毒囊膜糖蛋白GI的诱饵载体。将汉坦病毒76—118株囊膜糖蛋白GI基因与Ras基因连接,构建嵌合基因Ras—G1及Ras—G1’(G1’无前导肽序列)。将两个嵌合基因克隆入酵母表达载体pMet25,并转染至酵母温度敏感株cdc25-2,检测其对RRS系统的激活作用。限制性内切酶酶切鉴定表明,Met—G1和Met—G1’载体构建正确。激活试验为阴性。说明Met—G1和Met—G1’载体可用于从cDNA库中筛选汉坦病毒受体。     

彻底清除转化体中野生型DNA的专一位点诱变方法

我们设计了一种高效的专一位点诱变方法,可从混合体中清除野生型ＤＮＡ。并将所需突变ＤＮＡ转入被转化细胞中,如此合成了与一种ＤＮＡ分子目标序列一致的并带有能产生限制性内切酶位点的插入突变的两条互补的寡核苷酸链。利用野生型ＤＮＡ分子中的两端各有两个限制性位点的一段目标ＤＮＡ片段作为模板,上述合成的两种寡核苷酸引物被延伸、富集并分离。被延伸的产物在聚合酶链式反应中又反过来被用作模板,以获得突变的双链ＤＮＡ片段,此片段通过其两端的限制性位点能很方便地用侧面限制性内切位点克隆到质粒中去。用这些质粒转化的大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）细胞可进行大量的分析。通过集落杂交试验、限制性内切酶分析和ＤＮＡ序列分析,得知这些转化体百分之百含有突变型的ＤＮＡ序列。     

HSV-tk基因逆转录病毒重组体的构建与DNA序列分析

目的　构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (HSV1 tk)基因的逆转录病毒重组载体pLXSN TK。方法设计一对寡核苷酸引物 ,用PCR方法从质粒pHSV10 6中特异扩增HSV tk基因片段 ( 1168bp) ,分别用BamHI和Eco RI酶切后 ,定向连接到质粒pLXSN中 ,转化宿主菌TG1,分别用上述内切酶 ,PCR和DNA测序鉴定重组质粒。结果　酶切鉴定所切下的片段和PCR扩增的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论　成功构建了HSV tk嵌合重组质粒pLXSN TK。     

人噬菌体抗体库技术的发展

抗体库技术的出现得益于用PCR的方法人为地设计一组引物克隆出全套免疫球蛋白可变区基因,以及从大肠杆菌分泌有结合功能的免疫球蛋白分子的成功。1989年,Huse等［‘］将扩增的轻链和重链片段分别克隆到以入Z地改造的表达载体中,构建成轻链和重链库,然后将两个库随机重组形成了组合抗体库。由于在V基因的5’末端有分泌信号序列,所表达的Fab可分泌到细菌体外。由于对特异性抗体的筛选仍采用传统的“膜的原位杂交法”,所以在对库容量为10‘～10’的筛选时其工作量之大是可想而知的。为了克服随机组合文库的随机性强、库容量大、筛选系…