秋水仙素诱变离体卷丹多倍体的研究

用0.15%秋水仙素附加2.00%二甲基亚砜诱变离体培养的卷丹小鳞茎,避光条件下摇床诱导,用组织培养结合不定芽诱导技术获得了多倍体苗,并对多倍体染色体数目进行鉴定。结果显示,诱导96 h效果最好,变异率达到54.29%。细胞学观察发现,对照为三倍体、非整倍体和极少数单倍体细胞组成的嵌合体,诱变出的4棵变异株细胞分别为染色体数目由53~72条的不同比例构成,属于典型的非整倍的异倍型嵌合体。诱变株与对照植株间幼苗叶形指数、气孔密度及气孔大小等特征差异比较明显。     

抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４,设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ,反转录成Ｃｄｎａ,以Ｃｄｎａ为模板经ＰＣＲ扩增轻,重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至Ｐｕｃ１９质粒,筛选阳性克隆并测序,序列分析结果为重链３６６ｐｂ,编码１２２个氨基酸,轻链３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸     

大肠杆菌突变株高密度生长的多因素分析

【背景】pBHR68是表达聚-3-羟基丁酸酯(Poly-3-Hydroxybutyrate,PHB)合成基因簇的高拷贝质粒,大肠杆菌K-12突变菌株S17-3在携带该质粒时生长密度高,耐低p H且在低pH条件下生长时高产可拉酸(Colanic Acid,CA)。【目的】系统探究与菌种(大肠杆菌S17-3)及质粒(pBHR68)相关的高密度生长现象的分子机理,提示PHB和CA合成代谢与高密度生长的偶联机制。【方法】解析质粒的构成、CA合成途径基因组成对高密度生长现象的影响;利用全基因组同比分析寻找可能的关键突变基因;开展转录组学分析,筛查大肠杆菌S17-3及其转化子在不同培养方式中的转录组数据,通过基因敲除实现基因功能及细胞生长状态的验证。【结果】大肠杆菌S17-3的高密度生长菌与PHB合成的操纵子的过表达以及rhsA的多位点突变相关,RcsA是CA合成与高密度生长中碳代谢流调控的关键调控蛋白。在低pH培养时,敲除可拉酸合成的关键糖基转移酶导致生物量提升;此外,大肠杆菌S17-3/pBHR68的高密度生长还可能与乳糖操纵子异常的转录调控相关,lacZ突变株高密度生长特性消失,而且无法合成可拉酸。【结论】研究分析了引起大肠杆菌S17-3高密度生长的多种因素,为大肠杆菌提高生长密度现象的进一步分析提供了重要线索,也为利用大肠杆菌S17-3的优异生理特性将其改造为寡糖合成的底盘细胞奠定了研究基础。     

抗人CD3单链抗体与改形单域抗体的表达

设计并化学合成含有适当酶切位点及连接肽的寡核苷酸序列,与一定的背景载体连接并改造成适用于单链抗体表达的载体:外分泌型pWAI80和融合蛋白型pROH80从分泌抗人CD3单克隆抗体的杂交瘤细胞UCHT1中,经PCR扩增出轻、重链可变区基因V_H和V_K,并插入上述表达载体中构建成单链抗体基因.通过对鼠OKT3结合位点的结构模拟,并比较人、鼠抗体家族性保守序列,设计出改形OKT3的基因序列.化学法部分合成8个寡核苷酸片段,应用重叠PCR技术扩增出完整改形重链基因V_H,并克隆、酶切和测序鉴定.将所克隆V_H基因插入表达载体pCOMB3和 pGEX-4T-1中进行表达.经 IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和 Western blot分析以及 ELISA检测,结果发现分泌型表达产物及 M13基因Ⅲ-V_H改形单域抗体融合蛋白具有与CD3单抗竞争抑制的活性;而融合型单链抗体及改形单域抗体表达产物主要以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的 30％左右.     

紫穗槐幼苗根系生理特性和解剖结构对PEG-6000模拟干旱的响应

采用PEG-6000模拟干旱胁迫处理,测定了紫穗槐幼苗根系的可溶性糖、可溶性蛋白质、丙二醛、游离脯氨酸含量及SOD、POD酶活性变化以及解剖结构特征,旨在比较不同干旱程度对紫穗槐幼苗根系生理指标、内部解剖结构的影响,探索紫穗槐幼苗对水分胁迫的适应能力,揭示紫穗槐幼苗根系对土壤水分胁迫的响应和调控机制。结果表明:丙二醛含量变化显示当PEG-6000溶液浓度超过50g/L以后,紫穗槐幼苗根的膜系统开始受到损伤,并在PEG-6000溶液浓度达到250g/L受损程度显著增强,达到了对照的1.6倍,同时启动渗透调节作用(游离脯氨酸含量显著增加),达到了对照的3.8倍,在PEG-6000溶液浓度低于200g/L时,紫穗槐幼苗根系中至少没有启动以游离脯氨酸为主的渗透调节过程。可溶性糖和可溶性蛋白质含量及SOD、POD酶活性的变化印证了胞内发生的生理代谢变化,在PEG-6000溶液浓度为200g/L时,可溶性糖含量仅为0.121mg/g,达到最低点,随后上升,当PEG-6000溶液浓度进一步增加到250g/L时,紫穗槐幼苗根系中的可溶性糖含量则迅速回升到0.64mg/g,为对照组的63.37%。可溶性蛋白质含量在低浓度PEG-6000溶液(50g/L)处理下即有明显反应,下降到对照的61.5%,随后呈波动性变化。SOD和POD活性对PEG-6000模拟干旱胁迫的响应规律类似,均对PEG-6000模拟干旱胁迫处理迅速响应且活性增加。当PEG-6000溶液浓度达到50g/L至100g/L时,抗氧化酶的合成量最高,而后活性下降。60d的PEG-6000模拟干旱胁迫处理影响了紫穗槐幼苗根系的生长发育,随着PEG-6000溶液浓度增加,维管柱的直径变大,木质部厚度增大,导管直径变小、但导管密度增加,当PEG-6000溶液浓度达到250g/L时,导管密度比对照组增加了41.3%,木质部厚度比对照组增加了91.5%。以上结果表明,PEG-6000模拟干旱胁迫处理下,不同胁迫程度紫穗槐内部生理和根系解剖结构变化不同,通过改变自身生理代谢和根系内部解剖结构,以适应土壤水分胁迫的逆境条件,来满足自身生长和发育的需求平衡。     

碱性磷酸酶标记链霉亲和素

碱性磷酸酶标记链霉亲和素（AP-SA）是酶放大时间分辨荧光免疫分析（EATRFIA）通用的、最关键的试剂.报告了AP-SA的戊二醛二步标记方法.用自行研制的荧光发展溶液和AP的底物5-氟水杨酸磷酸酯测定了标记物AP-SA的特性,AP的标记回收率为38.7%;AP-SA稀释200～12 800倍时,稀释倍数和Tb的信/噪比呈线性关系;至少在两个月内,AP-SA的酶活性是稳定的.     

巨噬细胞RNA合成的某些特点

在低浓度(≤1μg/ml)放线菌素D作用下,兔腹腔巨噬细胞RNA合成被抑制的情况与兔肾细胞类似。但随着放线菌素D浓度增高,反而促进巨噬细胞的RNA合成。在浓度为100μg/ml时,可使~3H-尿苷的掺入量比对照增加2—10倍。相反,在此浓度下,兔肾细胞的RNA合成却完全被抑制。蔗糖的存在能使巨噬细胞丧失对放线菌素D这种刺激作用反应的能力,其RNA合成完全被抑制。另一方面,巨噬细胞的KNA聚合酶对利福平的敏感性要比其他非免疫细胞至少高4—5倍。如果用高浓度的(500μg/ml)利福平完全抑制巨噬细胞的转录之后,再     

神经生长因子的发光免疫分析法

介绍了一种灵敏的神经生长因子化学发光免疫测定方法。小鼠神经生长因子（ｍＮＧＦ）的抗体ＩｇＧ用亲和层析纯化并用吖啶酯标记。该法可用于大鼠组织中ＮＧＦ含量的测定。方法的灵敏度为１０ｐｇ／ｍＬＮＧＦ;批内批间变异系数分别为８．７％及１３．２％;回收率平均为１０３％。ｍＮＧＦ抗体对人的ＮＧＦ也有极强的交叉反应,故本方法也可能用于病人血清或脑脊液中ＮＧＦ含量的测定。     

铕标记抗癌胚抗原单克隆抗体C17的研究和应用

用合成的N′-(对-异硫氰基苄基)-二乙三胺-N¹,N²,N³,N³-四乙酸铕钠为螫合剂.用Sephadex G-50凝胶柱层析分离标记C₁₇和过量试剂.分部收集的层析物的光密度图和荧光强度图完全一致.蛋白峰处两管标记C₁₇的比活性分别为5.2和8.9Eu³⁺离子每C₁₇分子,而且C₁₇的标记回收率为64%.标记C₁₇至少在6个月内是稳定的.用铕标记物得到的时间分辨免疫荧光分析的标准曲线具有良好线性和斜率,表明标记物免疫活性良好,而且已用于血清CEA分析.     

噬菌体呈示单链抗体表达载体及小鼠非特异抗体库的构建

用大肠杆菌丝状噬菌体表面呈示技术构建抗体库的方法,为从抗原出发获得特异抗体提供了新的途径。报道的是,首先构建了一个用于噬菌体呈示抗体的噬粒表达载体ｐＦＵＷ８０,它具有既可以进行外分明表达,又可进行附着表达的特点。然后利用设计的一套扩增小鼠抗体重链和轻链可变区基因片段的ＰＣＲ引物,从未免疫小鼠脾细胞中扩增出了抗体重、轻链可变区基因,构建了一个１．２×１０６库容的小鼠非特异性单链抗体库。从这个抗体库中,筛选出了针对人ＩｇＧ的单链抗体噬菌体,并进行了ＥＬＩＳＡ检测和部分序列分析。这一初步结果为今后继续利用这一系统进行研究奠定了基础。