大肠杆菌16S rRNA的核酶设计和初步应用

针对细菌rRNA研发抑制细菌增殖的新型抗菌素是抗生素研究领域的新课题。细菌rRNA与基因mRNA一样自然形成折叠卷曲高级结构,其结构上可以结合反义核酸的位点即靶点,靶点的阐明是设计有效反义核酸、核酶（Ribozyme）和脱氧核酶（DNAzyme）的关键。MAST方法固定16S rRNA,将其与寡核苷酸文库杂交筛选出靶点,获得了大肠杆菌16S rRNA的6个反义核酸结合靶点,并鉴定5个靶点有效,其中1个为高效。5个靶点的反义核酸能在通透性大肠杆菌菌株培养中不同程度地抑制其生长,针对高效靶点的核酶在转化大肠杆菌中表达而抑制其生长。     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

绿色荧光蛋白基因mRNA反义寡核苷酸的筛选和应用

基因mRNA的靶点筛选是设计反义寡核苷酸的关键.建立了PARASS(polyAanchoredRNAaccessiblesitesscreening)方法,即通过在mRNA末端引入polyA,与生物素标记的polyT退火结合,将其同链亲和素磁珠混合,使mRNA通过3’末端得到固定,保持mRNA的自然伸展和折叠,与寡核苷酸文库杂交筛选mRNA的结合靶点.PARASS筛选获得了绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的3个反义寡核苷酸结合靶点,据其设计了多条反义寡核苷酸,与对照组相比,体外RNaseH分析显示3个靶点均为有效,在HeLa细胞内针对靶点的反义寡核苷酸能抑制GFP的表达,得到了Northern印迹结果支持.PARASS对反义寡核苷酸药物设计具有应用价值.     

反义寡核苷酸递送方法研究进展

如何将反义寡核苷酸 (AS ODNs)有效递送进入细胞是反义核酸领域面临的一大难题。近年来 ,出现了多种寡核苷酸 (ODNs)的递送方法。在培养细胞中 ,使用的递送方法包括阳离子载体包裹、特异受体的配体导向、ODNs偶联修饰、细胞膜辅助穿透以及利用逆转录病毒载体转染等 ,其应用有效增强了AS ODNs的作用效果 ,大幅度降低了AS ODNs的使用浓度 ;在体内 ,由于临床使用裸露AS ODNs连续给药能达到一定的反义效果 ,而使递送方法的研究和应用尚处于初步尝试和探索之中 ,迄今报道的递送方法有脂类和非脂类两类。