纳豆激酶基因在大肠杆菌中的表达及活性分析

目的:构建纳豆激酶基因的表达载体,鉴定其在大肠杆菌中的表达及表达产物的生物活性鉴定.方法:以纳豆芽胞杆菌基因组为模板,PCR技术克隆出纳豆激酶基因的成熟肽序列,分别克隆进具有信号肽的pMAL-p2x及无信号肽pMAL-c2x质粒中,经酶切和测序鉴定其正确性,分别将重组质粒转化至大肠杆菌中表达.结果:成功构建的两组重组质粒在IPTG诱导下,均能分别在37℃及16℃条件下表达出可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE胶检测证实重组质粒在大肠杆菌中可表达出相对分子量约76kDa的纳豆激酶蛋白.纤维蛋白平板实验证明两种融合蛋白均有活性,且有信号肽的融合蛋白的酶活较无信号肽的融合蛋白高.结果:成功构建了两组重组纳豆激酶基因的表达质粒,且该两组重组基因在大肠杆菌中可溶性表达并具有生物活性,因此为下一步研究表达产物纳豆激酶的功能、应用和生产奠定了基础.     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

siRNA作用效果的靶点依赖性

小分子双链RNA(siRNA)可以高效、特异地沉默目的基因表达 ,为基因功能研究及基因治疗提供了新工具。近年来研究表明针对基因mRNA不同位点随机设计的siRNA在作用效果上存在差异 ,siRNA作用效果有序列依赖性 ,而且与其在基因mRNA上的结合部位的高级结构有关 ,与反义核酸发挥作用的靶点依赖性类似。这一性质对设计高效siRNA为基因功能和基因治疗研究提供指导作用。     

“医学微生物学”慕课与翻转课堂混合式教学与传统式教学的比较

在"以学生为中心"的课堂教学改革中,需关注的主要问题是学生满意度和学生的表现。北华大学基础医学院"医学微生物学"慕课(Massive Open Online Courses,MOOC)是吉林省精品视频公开课,为充分发挥MOOC的优势,更好体现"以学生为中心"的教学理念,医学微生物学教研室采用基于慕课的翻转课堂(Flipped Classroom,FC)混合式教学模式进行了课堂教学改革。教学团队详细比较了临床医学专业中采用慕课与翻转课堂混合式教学模式与传统讲授模式在"医学微生物学"课程的教学效果,并对学生进行了2种教学方式的学习满意度调查。2组的独立样本t检验结果表明,MOOCFC混合式教学方式未影响学生考试成绩,2种教学模式下学生的表现及这2种教学方法有效性是相同的;成绩分析表明,实验组学生分析问题及解决问题的能力显著提升;调查反馈表明,学生对MOOCFC混合式教学中的自我学习能力与团队协作意识的提高更加满意,并且更喜欢MOOCFC课程所具有的灵活性及主动性。     

猪链球菌2型毒力因子研究新进展

猪链球菌是一种传染性革兰氏阳性菌,是严重影响养猪业发展的重要人畜共患病原体,造成人类死亡率在5%~20%。其毒力因子在致病过程中发挥着重要作用。近年来对猪链球菌2型的毒力因子研究有诸多新的进展,对其致病机制的了解和对该病有效防控都有新的认识。对近些年研究2型猪链球菌毒力相关因子,对蛋白质类、酶类研究的新进展,同时对毒力因子基因表达双组分系统、与宿主免疫系统相互作用的Ⅳ型分泌系统的进展进行总结和分析,以期为猪链球菌病的治疗和疫苗的研制提供新参考。     

Fas基因mRNA反义靶点筛选和体外验证

应用PARASS(poly-A anchored RNA accessible sites screening) 技术筛选Fas基因mRNA 获得3个潜在反义作用靶点,靶点1、2、3分别位于Fas基因297nt-317nt、619nt-639nt和662nt-682nt。设计了对应靶点的反义寡核苷酸A1、A2、A3,和10-23型DNAzyme D1、D2和D3。将反义寡核苷酸和Fas基因RNA结合再加入RNase H进行反应,10-23型DNAzyme则直接与Fas基因RNA作用,结果表明：3个靶点的反义寡核苷酸组及DNAzyme均能降解Fas基因RNA,为有效靶点,其靶点反应优势次序为靶点3>靶点1>靶点2;而非靶点对照组和有效靶点突变了2个碱基的对照组均没有反应。靶点2和靶点3与ISIS公司经过多次实验筛选到的Fas反义作用靶点位置基本相同,表明PARASS技术的有效性和可靠性。获得的有效反义寡核苷酸和DNAzyme为后续研究打下基础。     

金黄色葡萄球菌SarA、IcaA及其融合基因的DNA疫苗构建及在小鼠免疫应答中的初步研究

目的:探究SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG(Azami Green用AG表示)融合基因的DNA疫苗及对小鼠免疫应答的影响。方法:以金黄色葡萄球菌基因组为模板,通过PCR等反应进行SarA-AG、Ica A-AG及IcaA-SarA-AG融合基因DNA疫苗的构建,将DNA疫苗转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察DNA疫苗的瞬时表达情况,将转染成功2周后的细胞进行基因组提取,PCR检测质粒在染色体上的整合情况。使用AG、SarA-AG(A组)、Ica A-AG(B组)及Ica A-SarA-AG(C组) 4组免疫BALB/c小鼠,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG抗体、IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ及TNF-α的分泌情况。结果:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及Ica A-SarA-AG融合基因DNA疫苗,荧光显微镜下观察DNA疫苗转染情况,结果显示有绿色荧光。提取细胞基因组PCR检测结果显示未出现目的基因条带。免疫小鼠后,A、B、C组均能够诱导小鼠产生较高水平的IgG抗体。与空白组及空载体AG组相比,A、B组均能分泌较高水平的IL-2(P 0.001)、IFN-γ(P 0.001)、TNF-α(P 0.001)、IL-4(P 0.01)及IL-13(P 0.01),而C组TNF-α(P 0.05)、IL-4(P 0.05)及IL-13(P 0.05)分泌较少,但差异有统计学意义,细胞因子的分泌随着免疫次数的增加,差异显著增加。空白组及空载体AG组细胞因子无显著差异。结论:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及IcaASarA-AG融合基因的DNA疫苗,且成功在真核细胞中表达。PCR验证结果证实了DNA疫苗的安全性。DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和以Th1细胞为主的细胞免疫应答,具有较好的应用前景。