利用核糖体展示文库初步筛选与伤寒杆菌Ⅳ型纤毛结合的细胞受体

伤寒杆菌病原毒力岛上的Ⅳ型纤毛与伤寒杆菌的致病性密切相关,但对Ⅳ型纤毛在人巨噬细胞、树突状细胞上的受体及其序列或结合的关键部位还一无所知。本研究拟用核糖体展示库筛选伤寒杆菌结合的细胞受体。体外人工合成引物和含36个随机序列的寡核苷酸,通过两轮PCR构建随机DNA库,随后在体外进行偶联的转录和翻译,得到含随机12肽的核糖体库。利用含随机12肽的核糖体库与体外重组表达的Ⅳ型纤毛结构蛋白(PilS蛋白)进行了初步筛选,为筛选到与伤寒杆菌毒力岛上Ⅳ型纤毛结构蛋白结合的细胞受体奠定了基础。     

靶向B细胞并特异结合其分泌IL-10的重组融合蛋白的构建、表达和初步鉴定 *

目的:CD19单链抗体可变区(single-chain fragment variable)sc Fv能特异性识别结合B细胞表面的CD19分子,白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是调节性B细胞(Breg)的主要特征之一。旨在构建CD19sc Fv和IL-10受体1(IL-10R1)胞外段的重组融合蛋白,拟用该融合蛋白捕捉和封闭Breg细胞分泌的IL-10。方法:CD19sc Fv和IL-10R1胞外段克隆到p ET-28a原核质粒上,E.coli BL21(DE3)工程菌表达蛋白通过镍柱富集和纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达蛋白进行鉴定,Pull down实验验证蛋白与CD19分子和IL-10细胞因子的结合。结果:成功表达CD19sc Fv-IL-10R1融合蛋白,该融合蛋白能在体外同时结合CD19和IL-10分子。结论:CD19sc Fv-IL-10R1融合蛋白在体外可以同时结合CD19分子和IL-10分子,具有潜在应用前景可作为特异性抑制Breg的生物小分子。     

大鼠微小RNA miR-16的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的克隆微小RNArno—miR-一16,构建其慢病毒表达载体pLV—miR-16并包装成慢病毒颗粒,为进一步研究miR一16的功能奠定了实验基础。方法从大鼠细胞基因组中用PCR的方法扩增miR-16的前体,构建了miR-16的重组表达载体pLV—miR-16,脂质体法将重组慢病毒载体和包装质粒混合物（pPACK—GAG、pPACK—REV和pVSV）共转染包装细胞293TN细胞,包装产生慢病毒,以293TN细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达水平测定病毒滴度。结果经PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,成功构建携带大鼠miR-16基因重组慢病毒载体。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293TN呈绿色荧光,并测得10^8〉ifu／ml。结论成功构建大鼠慢病毒载体pLV—miR-16,为深入研究rno—miR-16的生物学功能奠定了基础。