幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

幽门螺杆菌Cag致病岛hp0523基因的缺失及其对CagA蛋白转运能力的影响

摘要: 【目的】构建幽门螺杆菌Cag致病岛编码的hp0523基因缺失株,为研究hp0523基因的功能奠定基础。【方法】本研究利用同源重组原理,设计并扩增了hp0523基因上下游同源臂片段,构建hp0523基因缺失自杀质粒pBlueKM40-?hp0523,电击转化进入幽门螺杆菌后,通过抗生素筛选后并经PCR验证无误后,获得hp0523基因缺失株H. pylori 11637?hp0523;采用幽门螺杆菌与胃癌上皮细胞BGC-823共培养后,分析该基因缺失前后对细胞毒性蛋白CagA转运能力的影响;并分析比较     

NCTC11637外膜蛋白36ku基因的克隆及序列分析

目的:对人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)36ku(OMP36)外膜蛋白进行基因克隆表达,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法:培养H.pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片断。将目的基因和PET32a( )同时经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,纯化,连接后,转化含有目的基因的重组载体,酶切鉴定后进行序列分析。结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为987bp,与GenBank公布的H.pylori 26695、ATCC43504及J99序列相比较,同源性高达94%-96%,推测的氨基酸序列同源性为97%-99%,GenBank登录号059968。结论:成功克隆了H.pylori 36ku的外膜蛋白的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了基础。     

幽门螺杆菌cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃部特定的病原菌,感染呈全球分布,感染率高达50%以上。现已证实它是轻度胃炎,消化性溃疡及胃癌的主要病因。Ⅰ型H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该片段只出现于致病相关菌株,基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,TFSS),通过转运相关毒素而参与H.pylori诱导上皮细胞细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NF-κB、诱导促炎细胞因子白细胞介素-8的表达等,故在H.pylori的致病中起着关键作用。近年来,研究者们致力于研究Ⅳ型分泌系统的功能,但是对于这个装置是如何转运蛋白进入宿主细胞的确切机制还是知之甚少,因此,对Ⅳ型分泌系统的研究将有助于进一步明确H.pylori致病机制,并为临床诊断和治疗提供新的靶点。     

MiR-107对柯萨奇病毒B3感染细胞糖原合成酶激酶-3β蛋白及β-连环蛋白表达的影响

【背景】MiR-107异常表达可引起肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路主要蛋白表达发生改变,但其能否在柯萨奇病毒B3（coxsackievirus B3,CVB3）感染的人宫颈癌细胞（HeLa cells）中发挥同样作用却未见报道。【目的】探讨miR-107能否影响CVB3感染HeLa细胞中的糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白、P-GSK-3β蛋白和β连环蛋白（β-catenin）的表达水平。【方法】体外培养HeLa细胞,感染CVB3不同时间,通过显微镜观察HeLa细胞的形态学变化、实时荧光定量PCR实验检测HeLa细胞中miR-107表达量、免疫印迹实验检测HeLa细胞中的GSK-3β、P-GSK-3β、β-catenin蛋白及病毒衣壳蛋白（VP1）的表达水平。【结果】CVB3感染HeLa细胞6 h后,细胞病变效应明显,miR-107表达量及GSK-3β、P-GSK-3β和VP1蛋白的表达水平随CVB3感染时间（0—8 h）的延长逐渐增加,而β-catenin蛋白的表达水平逐渐减少。过表达miR-107的CVB3感染6 h的HeLa细胞死亡细胞增多,GSK-3β、P-GSK-3β和VP1蛋白表达水平增加（P<0.05）,β-catenin蛋白表达水平减少（P<0.001）;抑制miR-107的CVB3感染6 h的HeLa细胞GSK-3β、P-GSK-3β及VP1蛋白表达水平明显减少（P<0.05）,β-catenin蛋白表达水平明显增加（P<0.05）。【结论】MiR-107异常表达可影响CVB3感染HeLa细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白和病毒衣壳蛋白的表达水平。     

异源表达的幽门螺杆菌cag4蛋白有溶菌糖基转移酶活性

摘要【目的】构建融合基因原核表达载体pET-28a- cag4,并表达重组融合蛋白cag4,分析重组融合蛋白的酶活性,为新型抗生素（或是抗菌药物）的研发提供作用靶位。【方法】本研究利用PCR技术从幽门螺杆菌NCTC11637中克隆了cag4基因;经T-A克隆,酶切鉴定,构建了原核表达载体pET-28a- cag4;经测序鉴定正确后,转化进入大肠埃希菌 BL21(DE3)进行异源表达。利用IPTG体外诱导后,经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定目的蛋白表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化目的蛋白,并对重组蛋白进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析。【结果】在大肠埃希菌 BL21(DE3)中获得高效表达的重组蛋白; 经SDS-PAGE和Western Bolt鉴定表达后,采用Ni2＋-NTA柱在变性条件下纯化,并进行透析复性处理。将SDS煮沸法获得的溶壁微球菌肽聚糖掺入SDS-PAGE作为底物,进行酶谱分析,表明目的蛋白具有明显的肽聚糖水解活性; 通过监测浊度下降速率,比较其在不同pH条件下活性的变化,即?A/（min?mg protein）,结果表明,幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。【结论】幽门螺杆菌cag4蛋白具有溶菌糖基转移酶活性。     

幽门螺杆菌cag PAI编码的Ⅳ型分泌系统

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃部特定的病原菌,感染呈全球分布,感染率高达50%以上。现已证实它是轻度胃炎,消化性溃疡及胃癌的主要病因。Ⅰ型H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该片段只出现于致病相关菌株,基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system,TFSS),通过转运相关毒素而参与H.pylori诱导上皮细胞细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NF-κB、诱导促炎细胞因子白细胞介素-8的表达等,故在H.pylori的致病中起着关键作用。近年来,研究者们致力于研究Ⅳ型分泌系统的功能,但是对于这个装置是如何转运蛋白进入宿主细胞的确切机制还是知之甚少,因此,对Ⅳ型分泌系统的研究将有助于进一步明确H.pylori致病机制,并为临床诊断和治疗提供新的靶点。     

幽门螺杆菌Cag-PAI hp0525基因的克隆表达及其重组蛋白HP0525对SGC-7901细胞增殖的影响

目的：由于文献报道幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）是产生胃溃疡和胃癌的致病菌之一,一个重要的影响因素是由cag致病岛编码的四型分泌系统。Hp0525是Cag致病岛中重要成分,是一种内膜蛋白ATPase。而幽门螺杆菌中Cag蛋白的表达以及Cag PAI编码的各自蛋白功能研究得还很少,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和研发幽门螺杆菌诊断试剂盒及疫苗,特克隆幽门螺杆菌NCTC 11637hp0525 (caga) 基因,并对其进行测序,构建原核重组质粒,表达HP0525蛋白,初步研究其对SGC-7901细胞增殖的影响。方法：应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增hp0525编码基因片段,克隆至pMD18-T载体后,再将其定向插入pET-30a载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,以DNA自动分析仪进行序列测定。测序分析正确后,经IPTG诱导表达,表达蛋白以Ni2＋-NTA柱进行纯化,并经Western blot和MALDI-TOF鉴定,透析除盐后的蛋白,通过免疫新西兰大白兔和抗体效价的测定,纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞,用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响。结果：成功克隆hp0525基因,全长993bp,编码330个氨基酸,与GenBank 公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%~99%。工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量为36 000,与预期一致,经Ni2＋-NTA柱纯化后可获得纯度为98％重组蛋白。蛋白作用于SGC-7901细胞后,结果呈现一定量的时间和剂量依赖性。它是一种ATPase,通过测定具有一定的活性。活性为4.40IU/ml结论：成功克隆hp0525基因,并在大肠杆菌BL21中表达,经过镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白, MTT法来检测出重组蛋白抑制细胞增殖;同时具有一定的酶活力,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统cagT基因的克隆表达及其重组蛋白对SGC-7901细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响

[目的]初步研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)NCTC 11637 cagT(HP0532)基因对SGC-7901细胞增殖和白细胞介素-8(IL-8)分泌的影响.[方法]应用PCR技术从H.pylori基因组DNA中扩增cagT编码基因片段,将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆.测序分析确认后,IPTG诱导表达,表达蛋白以Ni2 -NTA柱进行纯化,并经Western blot鉴定,纯化的蛋白作用于SGC-7901细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR扩增IL-8,并用MTT法检测蛋白对细胞增殖的影响.[结果]成功克隆了cagT基因,全长843bp(GenBank 登录号为 EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%～99%.工程菌诱导后SDS-PAGE显示新生表达蛋白带,相对分子质量约为32kDa,经Ni2 -NTA柱纯化后可获得纯度为98%重组蛋白.经透析复性后的蛋白(终浓度10μg/mL)作用于SGC-7901细胞后,可诱导细胞因子IL-8在mRNA水平上的表达.不同浓度CagT蛋白与SGC-7901细胞作用,细胞增殖的程度随着蛋白浓度的增加逐渐降低,细胞的增殖受到抑制.[结论]CagT蛋白可刺激SGC-7901细胞IL-8的表达,并抑制细胞增殖,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.