日本血吸虫三价DNA疫苗pVIVO2 SjFABP/Sj26.SjGAPDH的构建及其免疫保护作用评价

目的:构建含有日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(SjFABP),3-磷酸甘油醛脱氢酶(SjGAPDH),26kDa谷胱甘肽S转移酶(Sj26)的三价DNA疫苗,并通过药理实验评价其抗血吸虫感染的免疫保护作用。 方法:  以血吸虫成虫RNA为模板制备cDNA第一链,RT-PCR扩增得到抗原基因片段,再通过重组PCR技术,将Sj26和SjGAPDH融合为Sj26.SjGAPDH基因。将SjFABP和Sj26.SjGAPDH分别克隆入pVIVO2的mcs1和mcs2,获得重组质粒pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH。瞬时转染MCF-7细胞,通过逆转录PCR（RT-PCR）检测抗原基因在mRNA水平的表达,通过间接荧光免疫（IIF）检测抗原基因在小鼠体内抗原水平表达,验证了DNA疫苗的有效性;并免疫小鼠后进行免疫保护性初步试验。结果:  经过酶切、测序及体内外表达验证,该三价DNA疫苗pVIVO2-SjFABP/Sj26.SjGAPDH构建成功;该三价DNA疫苗在小鼠抗血吸虫感染中诱发减虫率和减卵率达到58.6%和59.8%。结论:  该三价DNA疫苗组具有比单价和双价DNA疫苗组更加良好的免疫保护作用,为日本血吸虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

人copineV蛋白多克隆抗体的制备

目的：制备兔抗人copineV多克隆抗体。方法：将copineV N端423bp（626-1048bp）构建到原核表达载体pET28a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家免3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用（NH4）2SO4沉淀法初步纯化抗体。结果：表达并纯化了copineV N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copineV。结论：制备了具有高亲和性和特异性的抗人copineV多克隆抗体。     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

血吸虫新抗原基因SjMF4的克隆、表达及功能分析

根据东方田鼠天然抗日本血吸虫病的现象 ,首次利用东方田鼠健康血清结合羊抗小鼠IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫cDNA表达型文库 ,获得两个阳性克隆 ,采用RACE技术对其中一cDNA片段进行扩增 ,获一含ORF的基因片段。序列分析表明该基因为一日本血吸虫新基因 ,命名为SjMF4 (SchistosomajaponicumMicrotusfortis 4 ,SjMF4 )。利用ExPASy的ScanProsite软件对此基因编码的蛋白质结构和功能域进行了分析。把该基因克隆到原核表达载体pET 2 8a( ) ,Western印迹显示表达产物具有良好的抗原性。又构建了真核表达质粒pcD NA3 SjMF4重组DNA疫苗 ,小鼠实验表明可诱导一定的保护作用。     

日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白编码基因的克隆和表达

根据日本血吸虫菲律宾株编码21.7kD蛋白的基因设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法扩增出大小为558bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白基因的完整阅读框,与菲律宾株该基因的碱基序列同源性为98%。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为25.4kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该基因的表达产物具有抗原性。     

人copine Ⅴ蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备兔抗人copine Ⅴ多克隆抗体.方法:将copineⅤ N端423 bp(626～1 048 bp)构建到原核表达载体pET28a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家兔3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用(NH4)2SO4沉淀法初步纯化抗体.结果:表达并纯化了copine Ⅴ N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copine Ⅴ.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗人copine Ⅴ多克隆抗体.     

DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

日本血吸虫未成熟卯单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原（SIEA）单链抗体（scFv）表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体．并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26-28ku特异性scFv大量表达．随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA2628ku天然分子候选疫苗相关的编码基因．结果显示,所获得的SIEA26-28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4．SIEA26-28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26-28ku的编码基因奠定了基础．     

日本血吸虫新抗原基因Sj—Ts4的克隆、表达及免疫保护性

为探讨旋毛虫感染小鼠后抗血吸虫感染的分子机制 ,并为血吸虫病疫苗的研究提供新的抗原分子 ,用旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库。经过 3轮筛选 ,获得 9个阳性克隆 ,其中新基因Sj Ts4有一完整的编码框 ,编码2 10个氨基酸。该蛋白质的理论分子量为 2 3kD ,等电点为 7.72。将Sj Ts4亚克隆于原核表达载体 pGEX 5X 3,以GST融合蛋白的形式在E .coliDH5α中表达。Western印迹分析显示 ,重组Sj Ts4蛋白 (rSj Ts4)能被慢性感染鼠血清识别。rSj Ts4或与弗氏完全佐剂混合后免疫小鼠 ,均可以诱导产生特异性的IgG抗体 ,抗体效价可高达 1∶2 5 6 0 0。两免疫组的减虫率分别为31.36 %和 36 .80 % ,与对照组相比都具有统计学意义     

人源核受体hLRH-1 的表达纯化及多克隆抗体制备

目的：制备抗人源核受体hLRH-1 的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。方法：构建含有hLRH-1基因全长克隆的 原核表达载体pET507a-hLRH-1 并用IPTG 诱导其在Rosseta2 菌株中表达重组蛋白His-hLRH-1,经亲和层析纯化后按常规方法 免疫新西兰兔制备多克隆抗体,并用Western Blot 对其特异性进行鉴定。结果：原核表达载体pET507a-hLRH-1经测序证实构建 成功,将其转化大肠杆菌Rosseta2菌株后成功诱导表达重组蛋白His-hLRH-1,经纯化免疫新西兰兔后得到抗hLRH-1 多克隆抗 体,Western blot 证实抗体具有高度特异性。结论：成功表达His-hLRH-1 重组蛋白并制备出多克隆抗体,为进一步用于hLRH-1 的 免疫学检测及其功能研究奠定了基础。     

白念珠菌MP65和SAP2蛋白原核表达质粒的构建与表达

目的构建以白念珠菌基因MP65和SAP2为目的基因的原核表达质粒,IPTG诱导其表达融合蛋白,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株获取MP65和SAP2基因,分别插入至原核表达载体pGEx．4T之和pET32a中;将重组表达质粒转染感受态EcoliBL-21,经IPTG诱导表达、纯化后,SDS—PAGE和Western blot分析。结果PCR法克隆出全长为1140bp的MP65和1197bp的SAP2基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-MP65及pET32a-SAP2,可分别表达出66KD左右的GST融合蛋白和His融合蛋白。结论成功获取了白念珠菌基因^伊65和SAP2,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;两种蛋白均有免疫原性。     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的表达狂犬病病毒糖蛋白（GP）,用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究。方法采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析。表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析。结果成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp。SDS-PAGE分析结果证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103。Western blot鉴定结果表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应。结论利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性。     

人谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺转移酶的体外表达、纯化及活性检测

目的:制备重组谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰胺转移酶(GFAT),检测其活性。方法:利用RT-PCR扩增人肝脏cDNA中GFAT1基因全长片段,克隆到表达载体pET32b中;在大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达,用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组GFAT1;用体外酶学的方法检测GFAT的活性。结果:构建了pET32b-GFAT1质粒,经诱导表达及纯化,得到具有一定生物活性的GFAT。结论:利用原核表达系统可得到具有良好生物学活性的重组人GFAT1。     

立氏立克次体外膜蛋白H基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的：克隆表达立氏立克次体（Rickettsia rickettsii）外膜蛋白H基因（ompH）片段并对其进行免疫原性分析。方法：采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果：获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论：pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

冠状病毒HcoV-229E S1蛋白的原核表达及鉴定

目的克隆表达冠状病毒HcoV-229E S1基因片段,表达S1蛋白。方法合成冠状病毒HcoV-229ES1蛋白特异性基因片段并克隆入pET21a原核表达载体,转化BL21（DE3）菌,经IPTG高效诱导表达得到重组蛋白,用金属螯合亲和层析纯化,并通过Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果获得了主要以包涵体形式存在的目的蛋白,Western blot鉴定其为S1基因片段蛋白。结论成功构建了HcoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,为下一步表达蛋白免疫原性及疫苗抗病毒保护性测定打下了基础。     

鞭毛蛋白FliC突变体／HPV18L2N融合蛋白的表达与纯化

目的：人乳头瘤病毒（HPV）的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏茵鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV18L2N（aa．13—154）的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达F1ic突变体与HPV18L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV18L2疫苗奠定基础。方法：以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliCD3区域（fliCAD3）、D3＋CD2a区域（fliCAD3CD2a）、D3＋D2区域（fliCAD2D3）的突变体,同时将HPV18L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS—PAGE及Westernblot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni—Sepharose亲和层祈纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native—PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果：构建了pET22b．fliCAD3／18L2N、pET22b—nic△D3cD2a／18L2N、pET22b—fliCAD2D3／18L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论：通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV18L2N的融合蛋白,为增强HPVL2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV18L2疫苗奠定了基础。     

鼠疫菌重要调控子蛋白的表达纯化及DNA结合活性分析

目的:利用大肠杆菌BL21(λDE3)的表达系统,表达7个有活性的、与鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)传播及致病密切相关的调控子蛋白,并对这些蛋白与DNA的结合活性进行分析,为构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络建立分子生化实验平台。方法:通过分子克隆技术构建鼠疫菌调控子蛋白的表达菌株,所得菌株经IPTG诱导后能分别表达鼠疫菌CRP、Fur、PhoP、OxyR、OmpR、RcsB和RovA带His标签的融合蛋白;对这些蛋白与DNA的结合基序进行生物信息学预测;通过体外凝胶迁移实验验证上述蛋白与靶DNA的结合活性。结果:表达了7种有活性的鼠疫菌调控子蛋白,这些蛋白与靶基因启动子区具有体外结合活性。结论:表达的7种调控子蛋白在鼠疫菌的传播致病中有重要作用,这些调控子蛋白与DNA体外结合实验平台的建立,是构建鼠疫菌毒力基因转录调控网络的基础。