人copine Ⅴ蛋白多克隆抗体的制备

目的:制备兔抗人copine Ⅴ多克隆抗体.方法:将copineⅤ N端423 bp(626～1 048 bp)构建到原核表达载体pET28a( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;以镍柱纯化后的蛋白为抗原,与等体积佐剂混合后免疫家兔3次;用ELISA和Western印迹检测抗血清,用(NH4)2SO4沉淀法初步纯化抗体.结果:表达并纯化了copine Ⅴ N端蛋白,ELISA检测表明抗血清具有高亲和性,Western印迹检测表明抗体能特异性识别内源性和过表达的copine Ⅴ.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗人copine Ⅴ多克隆抗体.     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

DNA损伤检查点蛋白调节子1片段的表达纯化及抗体制备

目的：原核表达、纯化DNA损伤检查点蛋白调节子1（MDC1）片段,并制备其多克隆抗体。方法：设计特异引物,通过RT-PCR扩增编码MDC1 N端194个氨基酸残基的基因片段,测序正确后插入含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果：原核表达并纯化了MDC1 N端片段,并获得了抗MDC1的多克隆抗体,抗体效价达到1∶12800,Western印迹显示该抗血清能特异识别原核及真核细胞表达的MDC1。结论：MDC1 N端片段能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MDC1在Fhit特异信号通路中的作用奠定了基础。     

Nono蛋白的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Nono （ non-POU-domain-containing, octamer-binding protein ）融合蛋白并制备抗Nono多克隆抗体。方法构建pET-28a（＋）-Nono重组表达质粒,转入Rosetta（DE3）大肠埃希菌,以IPTG诱导6×His-Nono融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-Nono融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫小鼠,获得了高特异性的抗Nono抗血清。结论成功构建pET-28a（＋）-Nono原核表达质粒,表达并纯化出高纯度的目标蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝癌细胞HepG2的活性检测及抗原表位鉴定

目的：检测制备的7株抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）蛋白C端单克隆抗体是否具有辅助杀伤肝癌细胞的活性,并研究其识别的抗原表位。方法：用细胞增殖法检测制备的抗体是否具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性;用生物信息软件分析GPC3蛋白C端（359～580残基）的结构及抗原特征,并据此将其分为4个截短片段,将克隆的各基因片段分别连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,进行蛋白表达和纯化,用间接ELISA和Western印迹分析GPC3C端单克隆抗体的表位识别情况。结果与结论：制备的7株单克隆抗体对肝癌细胞HepG2均具有不同程度的辅助杀伤作用,其中5号单克隆抗体的辅助杀伤效果最好;表达并纯化了GPC3C端4个截短片段的重组蛋白;间接ELISA和Western印迹检测结果表明,7株抗体均特异性结合GPC3蛋白的473～525残基区段。     

抗CD47胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

验证人CD47蛋白能否在新疆双峰驼中产生高滴度抗体;为制备高亲和力的抗CD47纳米抗体提供实验依据。构建CD47胞外区原核表达载体,诱导表达及纯化CD47蛋白,免疫新疆双峰驼。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot分别检测骆驼多克隆抗体的效价及与CD47蛋白特异性结合活性。结果显示,成功构建CD47胞外区原核表达载体,获得纯度大于90%的CD47蛋白,表达纯化的CD47重组蛋白可与抗CD47单抗B6H12.2特异结合;ELISA测定CD47重组蛋白免疫骆驼7次后,抗CD47多克隆抗血清的效价至少达到1∶200 000,免疫印迹检测表明抗CD47骆驼抗血清与CD47重组蛋白、Jurkat和Raji细胞表面表达的CD47均能特异结合。重组人CD47蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应。     

猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204 800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。     

猪FcγRIII的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：构建猪FcγRIII 基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备鼠抗猪 FcγRIII 抗血清。方法：从质粒pTG19-T-FcγRIII中用PCR方法克隆到编码完整猪FcγRIII蛋白分子的基因片段,将其插入到原核表达载体pET-32a中,构建了猪FcγRIII 原核表达载体pET-FcγRIII ,转化大肠杆菌BL21 (DE3) ,IPTG诱导蛋白表达,经尿素洗涤纯化后,以纯化后的融合蛋白FcγRIII-His 为抗原免疫小鼠,获得抗血清。Western blotting、ELISA 法鉴定获得的抗血清,ELISA 结果显示抗体效价为1∶16000,具有高度特异性,免疫印迹结果显示制备的多抗可以与重组猪FcγRIII蛋白特异性结合。结果：成功构建猪FcγRIII原核表达载体,纯化到融合蛋白FcγRIII-His,用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA 法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功获得了猪 FcγRIII 多克隆抗体,为进一步研究猪FcγRIII 蛋白的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

小鼠mP24基因的原核表达及多抗制备

目的：本研究是为后续实验中深入研究小鼠mP24基因的功能及活性提供mP24多克隆抗体。方法：mP24是小鼠中新发现的新基因,通过构建了pET-28a（＋）/mP24原核表达质粒,转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,IPTG诱导宿主细菌表达融合蛋白。经过SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白能以可溶性蛋白形式存在。利用镍柱纯化融合蛋白,免疫新西兰兔,制备mP24多抗。结果：Western Blot结果显示,制备的抗小鼠mP24多克隆抗体具有较高的特异性。ELISA实验检测,该多抗对免疫抗原的效价高达1：9000,具有较高的效价。结论：本实验成功制备了mP24的多克隆抗体,为进一步开展mP24基因功能的研究奠定了基础。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

糖基因Glt8d2重组蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的构建新糖基转移酶基因Glt8d2的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗GltSd2蛋白多克隆抗体并进行鉴定。方法应用RT—PCR技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增Glt8d2目的基因片段,构建原核表达载体pET-32a（＋）-Glt8d2。转化大肠埃希菌B121,异丙基-D-半乳糖苷诱导并通过SDS—PAGE凝胶电泳分析、Western印迹分析、生物质谱分析证实Gh8d2重组蛋白表达正确。大量表达后利用Ni’亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Gh8d2蛋白的多克隆抗体。以纯化的Glt8d2重组蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western印迹和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测。结果扩增获得Glt8d2基因片段,成功表达了Gh8d2重组蛋白,经SDS—PAGE凝胶电泳和Western印迹分析得到证实。成功获得重组蛋白及兔抗Gh8d2多克隆抗体。ELISA检测证实多克隆抗体效价〉1：320000。免疫组织化学分析显示,该基因编码的糖基转移酶在肝实质细胞内呈胞质模式表达分布。结论利用大肠埃希菌B121能够成功表达Gh8d2重组蛋白,获得高特异性、高效价兔抗Glt8d2重组蛋白的多克隆抗体,为今后研究Glt8d2基因的生物学功能研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。     

兔抗金黄地鼠酶标抗体的制备及应用

目的 纯化金黄地鼠血清IgG,制备兔抗金黄地鼠酶标抗体(IgG-HRP),开展金黄地鼠仙台病毒的初步检测.方法 采用亲和层析纯化法纯化金黄地鼠IgG,用SDS- PAGE电泳测定IgG纯度并制备兔抗金黄地鼠IgG抗体(second antibody,Ab2);用免疫双扩散法检测抗血清效价后,再用亲和层析纯化抗血清IgG( Ab2);采用改良过碘酸钠标记法制备兔抗金黄地鼠酶标抗体( rabbit anti-hamster IgG-HRP);用直接ELISA和Western-blot法对兔抗金黄地鼠IgG酶标抗体进行工作浓度测定;应用金黄地鼠酶标抗体对金黄地鼠仙台病毒进行酶免检测(IEA).结果 金黄地鼠血清IgG纯度达95％;兔抗金黄地鼠IgG抗体(Ab2)免疫双扩散效价为1(:)64;兔抗金黄地鼠IgG -HRP经直接ELISA和Western-Blot测定工作浓度分别为1∶5000和1∶2000;酶免(IEA)效价为1:2000.结论 高效快速纯化了金黄地鼠IgG,制备了金黄地鼠IgG-HRP,为金黄地鼠病原微生物的血清学检测提供了条件.     

新型α-半乳糖苷酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的：制备高效价、高特异性的新型α-半乳糖苷酶的兔多抗,并鉴定该抗体的特异性。方法：用脆弱类杆菌来源的基因重组α-半乳糖苷酶（纯度大于90％）免疫新西兰大白兔,获得α-半乳糖苷酶的兔抗血清,并经HiTrap rProteinA柱纯化获得高纯度的抗体;用间接ELISA法检测抗体效价,Western印迹评价抗体的特异性。结果：通过免疫法得到了α-半乳糖苷酶的兔多克隆抗体血清,抗体效价达1：1×10^6,经rProteinA柱纯化后获得了高效价、高纯度的抗体,Western印迹显示该抗体特异性地与新型α-半乳糖苷酶结合。结论：获得了新型α-半乳糖苷酶的高效价、高特异性的兔多克隆抗体,可用于血型转变过程中残留α-半乳糖苷酶含量的特异性检测。     

JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体的制备

目的制备pET-32a(+)-VP1蛋白的多克隆抗体。方法用纯化后的VP1蛋白分4次免疫兔子,颈动脉插管法取血,制得多克隆抗体。结果用ELISA法和Western blot鉴定多克隆抗体的效价得1?320000。该抗体可以用Western blot法检测出59 kD左右的VP1蛋白。结论成功制备高效价的JC病毒衣壳蛋白VP1多克隆抗体。