p66ShcA蛋白与机体衰老关系

p66ShcA蛋白是哺乳动物原癌基因Shc家族成员中的一员,除具有该家族特有的保守结构域（PTB和SH2）外,在N端具有特有的CH2结构域。当细胞在外界压力（H2O2、UV）刺激条件下,p66ShcA蛋白CH2结构域中36位的苏氨酸磷酸化,参与p53介导的凋亡信号通路,促进细胞凋亡。近年的研究阐明了氧应激引起的细胞凋亡和机体衰老之间的关系,因此,p66ShcA蛋白是联系细胞凋亡和衰老的交汇点。目前通过对p66ShcA蛋白转录方式的研究发现,p66ShcA蛋白启动子甲基化和p66ShcA蛋白的表达有负调控作用,所以对p66ShcA蛋白表达的调控,为延缓机体衰老及治疗由衰老引起的各种疾病带来新的思路。     

重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

目的：在大肠杆菌中表达大鼠脊髓损伤与修复蛋白39（SCIRR39）的C端抗原表位,并制备其多克隆抗体。方法：从大鼠脊髓全横断损伤脊髓cDNA中扩增1386bp的Scirr39基因编码框,亚克隆该基因编码蛋白C端359～461位氨基酸残基的DNA片段,插入表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况,切胶纯化目的蛋白;利用多克隆抗体制备技术,制备重组SCIRR39蛋白的多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western印迹检测抗体的特异性。结果：SCIRR39蛋白C端抗原表位与GST的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高表达,相对分子质量为37．9×103;获得抗SCIRR39蛋白C端抗原表位的兔抗血清,其效价达到1：104;Western印迹显示多克隆抗体能特异识别重组SCIRR39蛋白的C端抗原表位。结论：在原核系统中表达纯化了重组SCIRR39抗原表位蛋白,制备的重组蛋白多克隆抗体将用于检测SCIRR39在脊髓损伤过程中的表达变化。     

成年和老年小鼠脑蛋白质组双向电泳图谱比较

使用双向电泳(2-DE)比较成年和老年小鼠脑蛋白质差异,从分子水平初步探索老年脑蛋白整体变化规律.以固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-聚丙烯酰胺凝胶水平电泳(PAGE)为第二向进行2-DE.图象分析软件Imagemaster^® 2D Elite分析电泳图谱.重复性实验结果显示,同组样品在三次不同实验中所得蛋白质斑点数目的相对标准差（变异系数）为4.43%±0.25%;同一蛋白质斑点在三次实验中等电点、分子质量和蛋白质量的相对标准差分别为8.76%±5.14%, 13.00%±4.22%和10.84%±9.16%.成年和老年小鼠脑组织2-DE图谱分别获得996和1256个蛋白质斑点,其中8个蛋白质在老年脑组织中含量降低,20个蛋白质斑点含量增加.另至少有4个蛋白质斑点在老年脑组织中缺失,14个蛋白质点为老年脑特有. 以上差异点的发现为研究脑老化和退行性疾病机理提供了有益的线索.     

蛋白质双向电泳图像分析

随着人类基因组计划的接近完成,蛋白质组（proteome）研究成为新的热点.其中高分辨率的双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）技术使对组织或细胞的整个蛋白质组的综合分析成为可能.近年来这一技术有了很大的改进和提高,特别是图像分析系统,算法更为先进,功能日益强大,操作也更简便,为大规模研究提供了良好的工具.使用新一代的2D图像分析系统,对离体培养的雪旺氏细胞的蛋白质样品双向电泳结果进行了初步分析,探讨了在图像扫描、点检测、背景消除、匹配、结果报告和数据分析各步中的技术问题,并报告了进行2D图像分析的体会.     

HCN2在大鼠外周神经病理性疼痛发生中的作用

目的：初步探讨超极化激活的环核苷酸门控通道2型（HCN2）在外周神经病理性疼痛发生中的作用。方法：将24只健康成年大鼠进行随机分组（n=12）：假手术组（Sham）大鼠仅分离左侧L4、L5脊神经,模型组（SNL）分离脊神经后进行相应的结扎处理,手术7 d后用行为学方法进行模型评价;将造模成功的大鼠进行随机分组（n=6）：①阴性对照组（Saline）,左侧足底注射生理盐水;②阳性对照组（GBPT）,腹腔注射加巴喷丁;③实验组（ZD7288）,左侧足底注射HCN非特异性阻断剂ZD7288。在给药前以及给药后1 h、4 h、24 h、48 h用疼痛行为学实验检测其对神经病理性疼痛的作用;分别取手术前对照组（Control）、假手术组（Sham）和模型组（SNL）大鼠的背根神经节（DRG）（n=6）,利用qPCR和Western blot的方法研究造模前后大鼠DRG内HCN2的表达的变化情况。结果：①成功建立大鼠神经痛模型;②与Saline组比较,GBPT组和ZD7288组在注射1 h后,均能明显的减轻大鼠神经病理性疼痛的症状（P<0.01）,而GBPT组和ZD7288组之间比较则无差异;③与Control组和Sham组相比较,SNL组大鼠DRG内的HCN2 mRNA表达量明显增加（P<0.01）;与Control组和Sham组相比较,SNL组大鼠DRG内的HCN2通道蛋白表达量显著增加（P<0.05）。结论：HCN2参与外周神经病理性疼痛的发生,并有可能成为治疗神经病理性疼痛一个潜在的新靶点。     

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。     

克氏原螯虾用芽孢杆菌的特性及其安全性评价

为评估克氏原螯虾用产芽孢益生菌的特性和安全,本研究从市售益生菌产品中分离到19株芽孢杆菌属成员.通过测定抗菌活性、产纤维素酶活性、温度对生长影响来评价其益生菌的特性;通过测定芽孢对高温、低pH、胆汁酸盐的耐受、自聚集性和表面疏水性等评价其稳定性;通过溶血活性、抗生素敏感性、小鼠攻毒试验、克氏原螯虾饲养试验等评价其安全性.以抗菌和产纤维素酶活性、低温(15℃)生长快和无溶血活性这四项指标为标准进行筛选,结果表明:只有3株芽孢杆菌(B8,B20,B27)可成为益生菌候选株.在15℃低温时生长迅速、抗菌和产纤维素酶活性高的2株解淀粉芽孢杆菌(B14和B40)有溶血活性,能引起克氏原螯虾的肠炎,并导致肠道菌群中气单胞菌丰度显著上升.因此,在克氏原螯虾用芽孢杆菌益生菌的选择中,不仅要关注益生功能,更要考虑其安全性.本研究结果为芽孢杆菌在动物保护产品中科学评价和合理使用提供参考.     

中枢神经蛋白质组分析中双向电泳技术的建立

建立和优化了中枢神经组织蛋白质组分析所需的双向电泳及相关技术.由于中枢神经组织结构的特殊性,样品处理非常困难.对样品液组成、样品处理、上样方式、上样量、IPG胶条和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法和保存等相关技术进行了比较研究和条件优化后,以固相pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶（T=12.5%）的水平电泳为第二向,成功地得到了神经组织双向电泳图谱.     

MAPK/ERK kinase 2(MEK2)的全长三维结构

作为一种枢纽性的信号通路, Ras/Raf/MEK/ERK级联可被众多细胞外刺激激活, 进而将不同刺激信号传递到不同的底物分子. 其中MEK分子只有MEK1和MEK2两种, 它们如何介导众多信号, 一直是人们感兴趣的问题. 但由于技术局限, 一直难以得到MEK分子的完整三维结构, 限制了对此复杂机理分子水平上的研究. 利用同源模建与分子动力学模拟相结合, 构建了MEK2分子的完整结构, 并研究了其分子动力学特性. 结果显示, MEK2的N端部分具有非常高的柔性, 富脯氨酸环区和C端也具有相当的柔性. 这些结构特性提示, 对于不同的上游信号, MEK2有可能以相应的不同构象与ERK和/或其他上下游蛋白作用, 从而导致相应不同的下游效应.     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。