PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(MultiplexPCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)的原理和应用 。     

多重PCR及其在病毒性疾病诊断中的应用

多重PCR（muhiplex PCR）是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR技术。该技术可利用多对引物在同一个反应体系中同时扩增多段靶序列,目前广泛应用于科研及临床领域。该文简要介绍多重PCR反应条件的优化及其在病毒感染性疾病诊断中的应用。     

荧光定量PCR应用常见问题

1荧光定量PCR是什么荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ- PCR)是在PCR定性技术基础上发展起来的定量PCR技术。FQ—PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实现了PCR从定性到定量的飞跃。FQ—PCR仪在普通PCR仪的基础上加上了荧光探头和计算机。     

长PCR技术及其在动物学研究中的应用

长PCR(1ongPCR)技术自194年发明以来,在生命科学发展中发挥了巨大的作用。长PCR技术与常规PCR有较大的区别。本文从长PCR技术的由来、长PCR技术对模板、引物和聚合酶的特殊要求及长PCR技术反应条件等方面进行了较全面的介绍。最后介绍了近期发展的LR-IPCR(long range-inverse PCR,长反向PCR)、内切酶介导性长PCR(endonuclease-mediated long PCR)、long RT-PCR以及LDD-PCR。目前此技术在动物学研究中的应用主要在基因组测序和线粒体基因组研究、病理诊断、基因差异表达、病原微生物的研究、遗传多态性分析等领域。     

微量RNA的cDNA PCR文库的构建

使用PCR（polymerase chain reaction)技术,调制了mRNA的cDNA PCR文库,实验证明,cDNA PCR文库能使原cDNA的量放大数百倍,同时,使用人体K562培养细胞的总RNA,对cDNA PCR文库法和反转录中的β-Actin的cDNA量进行了比较,cDNA PCR文库法中的β-Actin的cDNA量大于高于反转录中的β-Actin的cDNA量,使用75pg的人体K562培养细胞的总RNA,调制成50ul的CDNA PCR文库,使用1ul的CDNA PCR文库进行了PCR反应时,可对文库中β-Actin的CDNA进行PCR检测,因此,CDNA PCR文库显示了良好的信息放大性能。     

焦磷酸显色法检测PCR产物及酶活性

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是分子生物学领域的一项具有划时代意义的技术,但定量PCR产物或测定能生成焦磷酸的酶活性仍需要新技术的发展。本文提供了一种PCR产物定性及定量检测方法(Color PCR kit)及其用途;该方法通过焦磷酸(pyrophosphate,PPi)显色测定PCR的副产物PPi。利用试剂盒中的试剂与PPi反应,最终生成物为甲暨（formazan）,呈红色。根据显色现象(红色)判断PCR的阳性结果,由目测实现PCR的定性检测;或通过测定490 nm 处的吸光度值定量检测PCR过程中生成的副产物PPi的含量,定量检测PCR 产物的生成量;目测情况下Color PCR kit可检测到2.5 ng水平的PCR产物,用紫外分光光度计可检测到低限为1 pg;Color PCR kit法比琼脂糖凝胶电泳检测法（低限为4 ng）灵敏。Color PCR kit还可用于连接酶和转移酶活性的测定。     

PCR—GeneScan法检测转基因产品

利用PCR－GeneScan技术检测转基因在豆和转基因玉米,该方法的特点是PCR扩增反应后,用Genescan扫描替代琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用此方法共检测了35S启动子,NOS终止子和抗除草剂（草甘膦）和抗虫（Bt)4种转基因成分,结果显示,本方法比传统的PCR一琼脂糖凝胶电泳法灵敏度高,重现性好,结果易判断,为分析检测转基因产品提供了一个实用,灵敏的方法。     

PCR技术的新进展

PCR是用于在体外快速酶促扩增特定DNA片段的技术,本文对PCR技术的一些新方法进行了简要综述,包括易错PCR,DNA shuffilng,原位PCR,电子PCR,固相PCR和PCR芯片。     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

液相原位反转录PCR:一种研究基因原位表达的有效方法

介绍了液相原位反转录PCR(inwellinsituRTPCR)的操作程序、存在的问题及改良方法,最后探讨了原位反转录PCR在研究RNA转录、加工、编辑和多聚腺苷酸化等方面的应用。     

一种简便高效的改良降落PCR

降落(touchdown,TD)PCR通常涉及15个退火温度,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR,只需5个降落退火温度,以杜氏盐藻(Dunaliellabardawil)基因组为模板,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关(carotenebiosynthesisrelated,cbr)基因的第3外显子。实验证实该方法程序简单,比标准降落PCR步骤简化70%,且产物的特异性及效率都有较大提高。     

肝素对血浆和组织microRNA的PCR扩增效率的影响

目的:研究肝素对血浆和组织microRNA(miRNA)提取及PCR扩增效率的影响。方法:将杂种犬9只,雌雄不分,随机分为两组,对照组(n=5)和实验组(n=4),实验组静脉注射肝素十分钟后取静脉血(用不含肝素的真空采血管采集)及左心室组织,对照组注射相对应量的生理盐水后步骤同实验组,应用miRNA试剂盒分别提取实验组和对照组血浆和组织的miRNA,逆转录成cDNA后进行实时定量PCR分析。结果:实验组与对照组比较血浆miRNA Ct值明显增高,其差异具有统计学意义(P0.01),组织miRNA Ct值无明显变化。结论:静脉注射肝素短时间内对血浆miRNA的PCR扩增效率造成明显影响,对组织miRNA提取及PCR扩增效率无明显影响。     

一种高特异性的改良降落PCR

为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验。自盐藻Dunaliella bardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝眩素生物合成相关基因（cbr）上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD-PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD-PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带。无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

PCR放大产物的转变与积累规律

本文提出了特异性DNA序列PCR放大机制中的一个新理论。首先从研究PCR放大产物的形成和来源组成特点人手,进而研究了它们的转变关系和积累规律,指出在任一PCR放大体系中所放大的目的产物—“短片段产物”拷贝数的积累量(S^NC）及其放大倍数（X^SN)与模板基数(C)、反应周期数（N）和反应效率(x)成一定的函数关系,即： S^NC=C[1/2(1+x)ⁿ-N] X^SN=1/2(1+x)ⁿ-N 计算机模拟结果表明,该理论值与PCR放大过程的试验观测值是一致的。     

甘薯丛枝病植原体的PCR检测

以报道的植原体（Phytoplasma)16SrDNA基因保守序列为依据,设计合成了两对引物对R16mF2/R16mR2和R16F2／R16R2,以甘薯丛枝病（SPWB）带病植株的叶脉中提取的DNA为模板,应用聚合酶链式反应（PCR）技术和巢式PCR（Nested-PCR)技术对甘薯丛枝病病原进行分子检测。结果表明PCR扩增出了1．5kb的特异片段,在PCB基础上的巢式PCR扩增出了1．2kb的特异片段,灵敏度实验显示该方法所需PCR模板DNA量为0．1073ng/ul在PCR的基础上的巢度PCR可以将灵敏度提高约10000倍,所需模板DNA仅为0．01073pg/ul,在甘薯丛枝病的检测中是一种快速,灵敏,可靠的方法。     

多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用

聚合酶链式反应(PCR)作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用.然而,多重PCR技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道.为深入探索多重PCR在质粒拷贝数测定中的应用,首先利用构建的多重PCR引物设计及评估体系分别针对细菌基因组DNA和质粒载体DNA序列设计多重PCR引物;然后以转化有不同质粒载体的大...     

数字PCR在食源性致病菌检测中的应用进展

食源性致病菌是食品安全的重大隐患,对人类健康造成极大危害,因此亟待研究和建立精准有效的食源性致病菌检测方法。随着单分子检测技术的快速发展,数字PCR技术因其具有超高的灵敏度、稳定性和低试剂消耗等优点而被广泛应用于食源性致病菌的检测。主要介绍了数字PCR的基本原理及其研究进展,深入探讨了其在检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、志贺氏菌（Shigella）、克罗诺杆菌（Cronobacter）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中的应用,为今后该技术在食源性致病菌检测中的研究与应用提供一定的技术性参考。     

大豆油中转基因成分的Nested PCR和Semi-nested PCR检测方法研究

对大豆油中DNA提取方法进行了研究,结果表明CTAB、SDS和Wizard试剂盒提取大豆油DNA均具有良好的效果。利用nested PCR和semi—nested PCR检测大豆（Roundup Ready）油中的转基因成分发现,该方法能够检测到大豆原油中的Lectin基因（112bp）、CaMV35S基因（147bP）和CP4-EPSPS基因（205bp）,检测灵敏度达到10^-6ng／μl;但该方法未能从人豆成品油（一级）中扩增到上述基因,当中的转基因成分DNA含量低于10^-12ng／μl。     

幽门螺杆菌全长基因cagA扩增及限制性酶切片段多态性研究

目的 建立扩增幽门螺杆菌全长cagA基因的方法并对扩增的原因进行限制性酶切片段长度多态性（RFLP）进行初步研究。方法 采用巢式PCR与TD－PCR结合的方法扩增cagA,运用EcoRI T HindⅢ酶切PCR产物。结果 20例标本中有13例的目的基因片段得到了扩增并得到了相应的EFLP指纹图谱。结论 （1）我们所建立的方法能较好地扩增cagA全长基因。（2)cagA基因含有重复序列,并显示RFLP的多样性。     

应用一步PCR法检测并鉴定马疱疹病毒1型和4型

聚合酶链反应（PCR）可作为一种快速检测并鉴别马疱疹病毒1型（EHV－1）和马疱疹病毒4型（EHV－4）的诊断方法。PCR引物是根据编码EHV－1和EHV－4的糖蛋白B（ gB)基因上的共有的核苷酸序列或型特有的核苷酸序列设计的。利用这两种病毒的型特异性混合引物,在一步PCR反应中检测并鉴别EHV－1和EHV－4,而同一疱疹病毒科的单纯疱疹病毒1型（HSV－1）、伪狂犬病毒（PRV）、马立克氏病病毒（MDV）均无特异性扩增。应用建立的PCR方法检测了普氏野马流产胎儿病科,实验结果表明,这种PCR方法是一种直接检测并鉴定EHV－1和EHV－4的快速、敏感的诊断方法,同时,它可在一步PCR反应中直接鉴别这两种病毒,可用于病料中EHV－1和EHV－4检测的初步筛选。