可可粉中几种外源植物源性成分的PCR检测

大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳是常见的几种可可粉外源掺假成分,根据它们所特有的基因片段设计引物,以高等植物18S rDNA基因为内参照基因,应用改良CTAB法抽提材料DNA,对分离的DNA进行PCR扩增并分析,建立了可可粉中这几种外源植物成分的快速检测方法。用建立的PCR方法对可可基因组进行扩增,均无特异条带;扩增出的PCR产物测序结果表明与目标片段一致;将各材料DNA倍比稀释,分别对各个稀释度的DNA进行PCR扩增。结果表明,该方法对大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳DNA检测的敏感度分别可达82．5pg／μl、32．5pg／μl、124pg／μl和157pg／μl。模拟样品试验发现,该方法的最低检测限（w／w）分别达0．5％、0．5％、5％和5％,可作为可可粉及其制品中这几种外源成分鉴别检测的有效方法。     

甘薯丛枝病植原体的PCR检测

以报道的植原体 (Phytoplasma)16SrDNA基因保守序列为依据,设计合成了两对引物对R16mF2/ R16mR2和R16F2/ R16R2,以甘薯丛枝病（SPWB）带病植株的叶脉中提取的DNA为模板,应用聚合酶链式反应（PCR）技术和巢式PCR（Nested- PCR）技术对甘薯丛枝病病原进行分子检测。结果表明PCR扩增出了1.5　kb的特异片段,在PCR基础上的巢式PCR扩增出了1.2　kb的特异片段。灵敏度实验显示该方法所需PCR模板DNA量为0.1073　ng/μl,在PCR基础上的巢式PCR可以将灵敏度提高约10000倍,所需模板DNA仅为0.01073　pg/μl,在甘薯丛枝病的检测中是一种快速、灵敏、可靠的方法。     

PCR对转基因玉米CBH351品系的鉴定检测

成功建立了转基因玉米CBH351（Starlink^TM)的筛选和品系鉴定检测的PCR方法,该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因来检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果,设计检测CaMV35S启动子的引物扩增195bp,来对转基因玉米进行筛选检测;并进一步设计转基因玉米CBH351（StarlinkTM)品系转化质粒图谱中CaMV35S启动子和Cry9C边界位置基因特异性引物扩增170bp,以及目标基因Cry9C的右端与CaMV35S终止子的左端边界位置基因特异性引物扩增171bp,以此来鉴定检测CBH351（StarlinkTM)的品系。     

抗草甘膦转基因大豆PCR的检测

目的:建立快速、有效的鉴别转基因作物与非转基因作物及其产品的检测方法体系。方法:用抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因引物,应用PCR方法,从中扩增出预期大小的DNA片段,将扩增产物回收后测序。结果:经同源性分析,扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因的一部分序列。结论:初步建立了转基因大豆的检测方法,同时讨论了PCR检测过程中假阴性和假阳性的原因。     

用PCR和SDS-PAGE两种方法对转基因大豆的检测

采用PCR和SDS-PAGE电泳两种方法对转基因大豆(美国)和非转基因大豆(国内3个不同样品)进行了检测．结果显示：转基因大豆可以检测出195bp的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV35S)序列片段和320bp的抗草甘膦基因(EPSPS)片段;SDS-PAGE蛋白质电泳中有一约40kDa的蛋白带出现;而非转基因的3个国内大豆品种中均没有CaMV35S启动子序列片段和抗草甘膦基因片段,SDS-PAGE蛋白质电泳检测也没有发现转基因大豆中存在的40kDa的蛋白带．     

色拉油中转基因成分的PCR检测

本文介绍了色拉油中DNA的快速提取法和PCR检测的方法。通过针对转基因大豆不同目的基因序列设计的两对引物来检测DNA。结果显示PCR方法简捷有效、灵敏且专一性强。本研究采用了一种稳定有效、重复性好、操作简便的DNA提取方法,可以促进食用油脂检测工作的进一步开展。     

Chelex-100快速提取用于转基因检测DNA模板的研究

目的:建立从转基因作物中快速提取DNA的方法.方法 :采用Chelex-100法提取抗草甘膦大豆和非转基因大豆、转基因抗虫玉米Bt176和非转基因玉米中的DNA,使用PCR扩增大豆和玉米的内源基因(Lectin,zSSⅡb)及外源特异性序列(CaMV35S,Bt176)评价提取核酸的质量.结果 :Chelex-100法能够快速在1h之内从大豆和玉米中提取DNA,所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰,转基因抗草甘膦大豆样品和转基因抗虫玉米Bt176检测均出现强阳性结果.结论 :Chelex-100法提取DNA可以作为转基因检测的模板,该方法具有经济、简便、快速的特点,适合于转基因检测工作.     

降落PCR法快速检测高羊茅转基因植株

通过CTAB微量提取高羊茅(Festuca arundinacea)转基因再生植株基因组DNA。用9600型PCR仪器设计降落PCR反应程序,对高羊茅转基因植株两个片段OSISAP1(495bp)和GFP-nos(1 000bp)进行扩增;同时进行了PCR扩增的初步检测。结果表明降落PCR法能快速准确检测转基因植株;而且更适合多个基因片段同时检测,从而提高PCR分子检测的效率,以提高转基因植株鉴定效率。     

荧光定量PCR检测人巨细胞病毒的方法学建立

目的建立人巨细胞病毒（HCMV）的TaqMan MGB探针荧光定量PCR（FQ—PCR）检测方法。方法选取HCMV MIE exon4为PCR扩增靶序列,经TA克隆构建重组质粒作为定量标准品,经FQ—PCR反应条件的优化及方法学评价,再将其应用于临床检测。结果FQ—PCR最适循环参数为：95℃ 5 min;95℃ 20 s,60℃ 60 s（40 cycles）,20μl最适反应体系为：2．0mmol／L Mg^2＋、0．5μmol／L引物、1．5μmol／L探针、200μmol／L dNTP、2110×buffer、1．0 U Taq酶、2．0μl DNA模板。检测批内CV（变异系数）值为1．32％,批间CV值为1．96％;特异性较好;线性范围为10^2-10^8copies／μl。结论成功地建立了检测HCMV的FQ—PCR法,完全适用于临床检测。     

Newleaf-YTM转基因马铃薯PCR检测鉴定方法的建立

建立了商业化种植的NewLeaf-Y^tm转基因马铃薯的筛选检测和鉴定的PCR方法。该方法根据马铃薯自身patatin基因作为内源特异参照基因扩增216bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果,同时扩增FMV35启动子基因225bp片段和PVY-CP基因161bp片段,PCR反应循环参数是94℃2min;94℃40s,55℃60s,72℃60s,35次循环;之后72℃延伸5 min。本实验中的F-PRIMER(pvy01-5)/r-primer(PVY01-3)引物是针对商业化种植的NewLeaf-y^tm转基因马铃薯PV-CP抗病毒基因而设计的,具有很强的特异性,可以达到对NewLeaf-Y^tm转基因马铃薯鉴定的目的。     

卫氏并殖吸虫PCR和实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的建立快速、灵敏、特异的分子生物学检测卫氏并殖吸虫的方法。方法根据卫氏并殖吸虫的特异性基因序列,设计适合于PCR检测的特异性引物及实时荧光PCR特异性引物和探针,并进行灵敏性和特异性试验。结果设计的引物和探针特异性强,所建立的检测方法灵敏度高。应用实时荧光PCR方法的检测灵敏度可达到0.1 pg/μL,比PCR方法的灵敏度高三个数量级。结论本研究所建立的PCR和实时荧光PCR技术检测卫氏并殖吸虫方法的特异性强,灵敏度高,为卫氏并殖吸虫感染的诊治提供了快速的检测技术手段。     

PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(MultiplexPCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)的原理和应用 。     

Template-blocking PCR: An advanced PCR technique for genome walking

This article describes the development of an improved method for the isolation of genomic fragments adjacent to a known DNA sequence based on a cassette ligation-mediated polymerase chain reaction (PCR) technique. To reduce the nonspecific amplification of PCR-based genome walking, the 3′ ends of the restriction enzyme-digested genomic DNA fragments were blocked with dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) and ligated with properly designed cassettes. The modified genomic DNA fragments flanked with cassettes were used as a template for the amplification of a target gene with a gene-specific primer (GSP) and a cassette primer (CP). The ddNTP blocking of the genomic DNA ends significantly reduced the nonspecific amplification and resulted in a simple and rapid walking along the genome. The efficiency of the template-blocking PCR method was confirmed by a carefully designed control experiment. The method was successfully applied for the cloning of the PGK1 promoter from Pichia ciferrii and two novel cellulase genes from Penicillium sp.     

纳米粒子PCR研究进展

纳米粒子PCR作为纳米技术与生命科学交叉的成果备受关注,对于推动分子生物学技术发展具有重要的意义。详细介绍了纳米粒子PCR的最新研究进展、作用机理,以及纳米粒子PCR应用的具体方面。     

红色毛癣菌菌株的特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种快速的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法。方法根据红色毛癣菌保守区域-真菌核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）设计特异性引物,采用上游：ITS19865＇GAC ACC AAG AAA AAA TTC TCT GAA GA3＇,下游：ITS24415＇GTC CTG AGG GCG CTG AA3＇为引物对45株红色毛癣菌、5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌菌株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果 45株红色毛癣菌均能扩增出目的片段,5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌均无目的片段扩增出。结论红色毛癣菌可用特异引物PCR方法快速鉴定。     

一种简便高效的改良降落PCR

降落(touchdown,TD)PCR通常涉及15个退火温度,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR,只需5个降落退火温度,以杜氏盐藻(Dunaliellabardawil)基因组为模板,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关(carotenebiosynthesisrelated,cbr)基因的第3外显子。实验证实该方法程序简单,比标准降落PCR步骤简化70%,且产物的特异性及效率都有较大提高。     

Drop-in, drop-out allele-specific PCR

Allelotyping large numbers of samples by allele-specific polymerase chain reaction (PCR) can be problematic if the DNA samples to be tested are of highly variable concentration. On the one hand, analysis of dilute DNA samples often requires nested PCR to produce a product of sufficient yield to be detectable on ethidium bromide-stained agarose gels. Such two-step assays require additional reagents, are labor-intensive, and have a higher risk of contaiminations. On the other hand, the specificity of allele-specific PCR assays can be lost at high input DNA concentrations. Large population-based genetic studies using DNA from varied sources would benefit from one-tube assays that could detect mutations in samples over a wide range of concentration. We describe a one-tube nested allele-specific PCR-based assay, in which the input DNA concentration has little effect on the assay’s yield or specificity. An assay using this method is highly sensitive and specific, and was used to type several thousand DNA samples, obtained from various sources, for a G to A transition at human transthyretin codon 122. Similar assays could be readily adapted to any high-throughput allelotype assay where input DNA is of highly variable concentration.     

Nested real-time PCR for hepatitis A detection

Aims:  The hepatitis A virus (HAV) is one of the most important human foodborne pathogens causing a number of worldwide outbreaks each year. The detection of HAV in food samples remains a complex issue, because commonly used detection tools, such as conventional or even real-time PCR assays, are often unable to detect HAV with sufficient sensitivity. The aims of this study were to develop highly sensitive and specific nested real-time PCR (NRT-PCR)-based method for HAV detection in food and to compare it with currently available methods.
Methods and Results:  By combining conventional PCR, nested PCR and real-time PCR techniques, we have developed a specific NRT-PCR assay for the detection of HAV. The procedure involves two consecutive PCRs, the first of which is performed as a conventional RT-PCR using primers specific for HAV 5' noncoding region. The second reaction involves a real-time PCR using a nested primer pair specific for the first PCR product and a TaqMan probe.
Conclusions:  We have developed a novel NRT-PCR method capable of detecting as little as 0·2 PFU of HAV, which is significantly more sensitive than any other PCR technique tested in our system.
Significance and Impact of the Study:  NRT-PCR provides a potentially useful method for detecting HAV at extremely low levels, as frequently found in food samples, and can be potentially adopted as a regulatory method to ensure food safety.     

一种高特异性的改良降落PCR

为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验。自盐藻Dunaliella bardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝眩素生物合成相关基因（cbr）上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD-PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD-PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带。无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

绵羊肺腺瘤病特异性PCR及套式PCR诊断方法的建立

绵羊肺腺瘤是由外源性反转录病毒JSRV引起的接触性传染的肺肿瘤性疾病。感染羊没有针对JSRV的循环抗体,但在感染羊的肺肿瘤组织、淋巴网状系统及外周血单核细胞中可检测到外源性前病毒exJSRV及JSRV转录产物。健康羊基因组中存在15~20拷贝的内源性前病毒enJSRV,内外源性前病毒的结构基因高度相似,而在U3区存在差别,因而,设计了针对exJSRVU3区的特异性引物并在国内首次建立了一步法特异性PCR检测法及套式PCR检测法。以700ng健康羊基因组DNA为背景,梯度稀释阳性质粒pJSRV-LTR作为模板,比较两种方法的敏感性,结果表明套式法的敏感性是一步法的10倍以上,套式法也是目前可用于检测感染羊血液样品的唯一方法,可望在绵羊肺腺瘤病的流行病学调查及防控方面起重要作用。