DNA错配修复蛋白MutS和MutL的相互作用研究

MutL 和 MutS 是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白. 利用基因融合技术高效表达了MutL 和 MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法. 融合蛋白MutL-GFP (Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-Strep tagⅡ (Trx-His6-(Ser-Gly)6-Strep tagⅡ-(Ser-Gly)6-MutL) 和 MutS (Trx-His6-(Ser-Gly)6-MutS) 被构建并在大肠杆菌中高效表达. 收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分析,结果表明有与预期分子质量相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30％且以可溶形式存在. 利用固定化金属离子配体亲和层析柱分别纯化融合蛋白,其纯度达到90％. 通过将MutS蛋白固定的方法研究两种MutL融合蛋白分别与MutS之间的相互作用. 结果表明：只有MutS蛋白与含有错配碱基DNA分子结合后才与MutL蛋白发生相互作用. 通过检测MutL融合蛋白标记的绿色荧光信号或酶学显色信号来鉴定相互作用的发生. 建立的融合分子系统方法也为研究其他的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台.     

蔗糖-葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶(INV)酶管与葡萄糖氧化酶(GOD)-葡萄糖变旋酶(MUT)双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α-D-葡萄糖,再用COD-MUT双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径(Ws和Wg)时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适pH和温度范围分别为:5.0—6.5和30—40℃。在稳态法实验中,传感器的线性范围为:2.5×10~(-4)—5×10~(-3)mol/L。传感器的重复性很好,CV<1％。该传感器在用于测定发酵培养基(含葡萄糖)的蔗糖含量,平均回收率为97.9％。传感器与糖度计法测定的相关系数为0.997。传感器至少可以稳定使用8天以上。     

鼠Ⅰ型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素 １受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用。以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体（ｓＩＬ－１　ＲＩ）基因。以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－ＩＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经同源重组得到重组杆状病毒ｒＡＣＮＰＶ。应用经纯化的ｒＡｃＮＰＶ感染昆虫细胞Ｓｆ９,表达获得重组的ｓＩＬ－１ＲＩ。经对亲和层析样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和对ＩＬ－１β生物活性阻断作用实验证实,表达产物能够与其配基结合,并且能够分泌至细胞培养上清中。     

鼠I型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素１受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用,以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体基因,以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－１ＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,     

DNA传感器研究进展

本文概述了当前生物传感器的研究特点以及发展ＤＮＡ生物传感器的迫切性;从不同角度阐述了ＤＮＡ生物传感器的概念和研究内容;着重讨论了ＤＮＡ生物传感器的研究现状和发展趋势。文中分别对ＤＮＡ光生物传感器和ＤＮＡ压电晶体生物传感器的基本原理、特点、研究进展及存在的问题进行了分析与说明。进而,对我国ＤＮＡ生物传感器研究存在的差距和发展前景进行了简要论述。     

蔗糖酶在尼龙丝上的固定化及酶管性能研究

利用盐酸水解法处理尼龙丝表面,采用戊二醛交联法将蔗糖酶固定在尼龙丝上,制成酶丝,进而制成酶管.该酶管可用于蔗糖的测定,蔗糖通过酶管分解成葡萄糖,再用葡萄糖氧化酶(GOD)电极测糖.酶管的最适 pH 为5—6,最适温度范围:30—40℃.溶液的流速对酶管的转化效率有显著影响.流速为1.3ml/min 时,蔗糖浓度在0—5mmol/L 范围内,酶管的转化效率基本恒定,约为28.5%.用同一浓度的蔗糖溶液重复实验,酶管的重复性很好,CV＜1%。酶管活力至少稳定8d(天)以上.     

MutL融合蛋白的高效表达及其伴侣功能研究(英文)

DNA错配修复蛋白MutL和其它的修复蛋白相互作用来共同完成大肠杆菌甲基介导的错配修复过程 .为研究修复蛋白MutL的体外生物功能构建了融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutL(THLL)的表达载体并使其高效表达及易于纯化 .mutL基因片段是以E .coliK 12基因组为模板经PCR扩增获得 ,并通过基因的体外拼接成功构建了融合蛋白THLL表达载体pET32a linkerpeptide mutL .重组菌株E .coliAD4 94 (DE3) pET32a linkerpeptide mutL经过IPTG的诱导表达了融合蛋白THLL .收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS PAGE分析 ,结果表明有一与预期分子量(84kD)相应的诱导表达条带出现 ,其表达量约占全细胞蛋白的 30 %且以可溶形式存在 .利用固定化金属离子 (Ni2 +)配体亲和层析柱纯化融合蛋白THLL ,其纯度达到 90 % .通过非变性凝胶电泳分析 ,对融合蛋白THLL在DNA错配修复过程中的分子伴侣生物功能进行了系统研究 .结果表明 ,THLL能增加融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutS (THLS)与含有错配碱基DNA双链的结合 ,但受ATP的浓度变化影响很大     

病毒性趋化因子vMIP2的表达、纯化及生物活性研究

趋化因子受体如CCR5和CXCR4是HIV侵入细胞的辅助受体,趋化因子与其受体的结合可以抑制HIV感染细胞.近年来在疱疹病毒8(Human herpesvirus 8, HHV8)基因组中发现与人趋化因子有较高同源性的开放阅读框,分别命名为vMIP1、vMIP2和vMIP3.研究发现vMIP2与多种人趋化因子受体有高亲和力.本研究在大肠杆菌中表达出融合蛋白TrxA- vMIP2,用亲和层析的方法对其纯化.纯化产物用肠激酶酶切后,经离子交换层析纯化出目的蛋白vMIP2.体外活性研究表明纯化的vMIP2 可以有效地抑制R5和X4 HIV-1在人外周血单核细胞上的复制.     

PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(MultiplexPCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)的原理和应用 。