前脑特异性CCKR-2双转基因小鼠的繁育及基因鉴定

摘要 目的：繁殖及鉴定可调控前脑特异性胆囊收缩素受体2（Cholecystokinin receptor-2,CCKR-2）双转基因小鼠（tTA/tetO- CCKR-2 double transgenic,简称dtg）,为进一步研究CCKR-2在焦虑相关疾病,如焦虑症、恐惧行为、创伤后应激障碍等发病过程中的作用及分子机制提供实验模型。方法：（1）利用α-CaMKII/tTA单转基因小鼠与tetO/CCKR-2单转基因小鼠杂交,所得子代尽可能远亲繁殖获得dtg小鼠,提取子代鼠尾基因组DNA,采用PCR法及琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物以确定其基因型;（2）采用原位杂交方法验证CCKR-2双转基因前脑特异性表达,筛选CCKR-2双转基因型及前脑特异性表达者作为继代种鼠和实验用鼠。结果：（1）PCR凝胶电泳图显示清晰的tTA（350 bp）和CCKR-2（550 bp）条带,野生型无条带显示,表明琼脂糖凝胶电泳结果与dtg模型预期基因片段大小相符;（2）原位杂交结果显示dtg小鼠前脑区域有强烈的CCKR-2表达而野生型小鼠不明显。此结果表明dtg双转基因小鼠在本实验室的成功建立与繁殖及继代,同时繁殖出更多的dtg小鼠。结论：通过正确的饲养繁育和基因鉴定方法能成功获得dtg双转基因小鼠,为本实验室进行后续相关研究奠定了基础。     

转基因抗草甘膦油菜的检测方法

目的:建立检测田间转基因抗草甘膦油菜的方法。方法:用CTAB法提取DNA,经PCR分别扩增内参基因BnACCg8,及抗草甘膦外源基因CP4-EPSPS、FMV 35S启动子和E9 3’终止子等4种基因的片段,以琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析比对。结果:抗草甘膦油菜中分别扩增出与外源基因FMV 35S启动子、E9 3’终止子和CP4-EPSPS大小一致的片段。结论:该方法能有效地用于转基因抗草甘膦油菜的检测。     

转基因棉籽检测中DNA模板提取方法研究

在转基因棉籽的检测中,需要得到合适的DNA模板,以进行PCR扩增。应用CTAB1,CTAB2,KIT,KIT1,SDS等五种DNA模板提取方法提取转基因棉籽中的DNA模板,根据模板DNA的OD260/OD380值,波长扫描,琼脂糖凝胶电泳,3个基因的PCR扩增结果,评价五种DNA模板提取方法的提取效果,发现以KIT1方法提取棉籽中DNA模板效果为好,可用于实际检测中。     

筛选转基因动物的新方法——PCR及其产物测序法

用特异性引物对肌球蛋白轻链2启动子(myosin light chain-2,MLC₂)-糜酶融合基因的转基因新生鼠鼠尾DNA进行PCR筛选, 低熔点琼脂糖凝胶电泳回收阳性样品PCR所扩出的DNA条带,纯化后用同一对引物中的一个进行单引物PCR测序,与所转外源基因序列比较,进一步确定整合有外源基因的阳性鼠.PCR及PCR 产物测序法检测转基因动物具有操作方便,灵敏度高及特异性强等优点.     

荧光Real-time PCR鉴定鸡胸骨总RNA质量

为了更准确地鉴定提取鸡骨总RNA的质量,试验分别用核酸蛋白检测仪、1%琼脂糖凝胶电泳和荧光Real-time PCR检测评价3种不同的方法提取成年鸡胸骨总RNA的质量。结果显示,荧光Real-time PCR可更好地鉴定提取的骨总RNA的质量。用核酸蛋白检测仪、1%琼脂糖凝胶电泳能粗略检测RNA的纯度和完整性,但不能反映提取过程中是否引起基因不均一的减少,所检测的纯度也不能精确反映RNA的反转录效率。     

琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因

采用常规的PCR方法检测低拷贝数转基因有一定困难.提出一种使用琼脂糖凝胶直接杂交的方法,结果明确、简单可行,是转基因动物中低拷贝数转基因鉴定的一种较好方法.     

焦磷酸显色法检测PCR产物及酶活性

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是分子生物学领域的一项具有划时代意义的技术,但定量PCR产物或测定能生成焦磷酸的酶活性仍需要新技术的发展。本文提供了一种PCR产物定性及定量检测方法(Color PCR kit)及其用途;该方法通过焦磷酸(pyrophosphate,PPi)显色测定PCR的副产物PPi。利用试剂盒中的试剂与PPi反应,最终生成物为甲暨（formazan）,呈红色。根据显色现象(红色)判断PCR的阳性结果,由目测实现PCR的定性检测;或通过测定490 nm 处的吸光度值定量检测PCR过程中生成的副产物PPi的含量,定量检测PCR 产物的生成量;目测情况下Color PCR kit可检测到2.5 ng水平的PCR产物,用紫外分光光度计可检测到低限为1 pg;Color PCR kit法比琼脂糖凝胶电泳检测法（低限为4 ng）灵敏。Color PCR kit还可用于连接酶和转移酶活性的测定。     

几种直接从高温热泉沉积物中提取DNA方法之比较

用酶解法,化学裂解法和微波炉法,冻融法等物理裂解方法组合出5种方法直接从滇西一个高温热泉沉积物提取DNA。经常规的琼脂糖凝胶电泳检测,发现用溶菌酶,蛋白酶K酶解,SDS化学裂解结合微波炉法裂解不仅可以得到较大量的DNA。而且碎片段较少,提取出来的DNA经RNA酶和蛋白酶K处理后可直接进行PCR扩增。同时DGGE（变性梯度凝胶电泳）电泳检测,结果表明,此法不仅可以得到该种环境中较多微生物分类单位的DNA,而且还能够较好地体现出它们在量上的差异。     

实时荧光定量PCR检测人肿瘤细胞NKG2D配体基因表达

目的：建立人肿瘤细胞NKG2D配体基因（MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3）表达的实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitativePCR）检测方法。方法：根据NCBI基因库中NKG2D配体基因序列,设计合成引物。用Trizo1法从培养的肿瘤细胞（BEC-7402、HeLa、MDA-MB-435、XWLC-05）中提取总RNA,逆转录成eDNA,建立实时荧光定量PCR检测NKG2D配体基因表达的方法,并检测NKG2D配体在肿瘤细胞株中的表达。结果：经过琼脂糖凝胶电泳、熔解曲线和标准曲线分析,用所设计的引物和SYBR GreenI能够特异扩增和定量检测NKG2D配体基因的表达。该方法成功检测4种肿瘤细胞NKG2D配体基因的表达。结论：建立了人NKG2D配体基因表达的实时荧光定量PCR检测方法,为进一步研究人NKG2D配体在肿瘤免疫中的作用提供了有效手段。     

肝素对逆转录抑制作用的研究

目的:研究肝素在逆转录过程中的作用.方法:提取人肺胚胎二倍体细胞和肝素抗凝血中总RNA,经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量好后,逆转录合成相应的cDNA,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;用基因芯片技术检测cDNA.将肝素抗凝血中提取的总RNA分为等量的两部分,分别用肝素酶或氯化锂处理RNA进行逆转录为cDNA和RNA合成cDNA后再用肝素酶或氯化锂处理,分别进行看家基因β-actin的聚合酶链反应(PCR),其产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测;并用基因芯片技术检测氯化锂处理RNA后cDNA.结果:二倍体细胞来源的RNA为模板,能扩增出β-actin产物,并且在基因芯片上有杂交点.肝素抗凝血来源的RNA,在肝素酶或氯化锂作用后行逆转录者,能扩增到β-actin的目的片段,且基因芯片上有杂交点;而在未处理者不能扩增到目的片段,且基因芯片上无杂交点.结论:肝素是一种逆转录的抑制剂.对RNA逆转录cDNA过程有较强的抑制作用.