破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法．从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71．甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

人HPPCn重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测

HPPCn是一种新的肝细胞刺激因子,获得较高纯度的具有生物活性的HPPCn蛋白对研究其生物学功能具有重要意义。HPPCn在重组质粒PET-24a(+)/HPPCn中,诱导表达产物主要以包涵体形式为主。为优化表达条件,运用冷休克表达载体pColdⅡ和无缝克隆技术获得重组质粒pColdⅡ/HPPCn,分别对诱导温度、时间、分子伴侣等诱导条件进行筛选,镍离子柱亲和层析纯化,Western blot分析目的蛋白特异性,不同浓度人HPPCn重组蛋白(0、10、100ng/ml)刺激SMMC7721细胞,免疫细胞化学方法测定Brdu掺入、PCNA表达变化。目的蛋白在培养温度为16℃,终浓度为0.1mmol/L的IPTG过夜诱导时为可溶性表达,最终得到人重组HPPCn蛋白纯度为94.88%,人HPPCn重组蛋白可刺激SMMC7721细胞Brdu掺入增加、PCNA表达水平上调,其刺激作用具有量效关系。通过冷休克表达系统获得可溶性表达的人重组HPPCn蛋白,其具有促进SMMC7721细胞增殖的生物学功能,为深入研究HPPCn的作用机制提供了技术条件。     

人黑色素瘤相关抗原Restin的克隆和表达

目的:通过对原核表达载体、表达条件和宿主菌的优化,利用原核表达系统有效表达可溶性的人Restin融合蛋白.方法:应用PCR方法扩增获得Restin编码区,克隆入原核表达载体pET44a(+),分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3),不同的IPTG浓度诱导表达Restin重组融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物.结果:成功构建了重组载体pET44a(+)-Restin,并在E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3)中获得了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的8.9%.结论:可溶性Restin融合蛋白的获得为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础.     

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展

大肠杆菌表达重组蛋白相比真核细胞具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点,通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径,重组蛋白表达量可达到大肠杆菌总蛋白质量的50%。具有正常生化活性的重组蛋白通常为可溶性形式,因而对于以得到活性产物(如抗体、酶等)为目的的研究,通常采用可溶性表达途径。目前已有多种以可溶性重组蛋白为活性物质的治疗性药物经批准上市,但并非所有外源基因均能实现可溶性高表达,因此重组蛋白的可溶性高表达具有重要研究价值。在总结近年提高经大肠杆菌可溶性表达重组蛋白产率研究的基础上,从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质,高密度发酵等方面阐释在大肠杆菌中提高可溶性重组蛋白表达产率的方法。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度(16℃)有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

目的:重组新蛭素(EH)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(EPR)的衍生物,以往EH的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高EH的生产效率,探索了EH在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过PCR的方法获得eh的cDNA,PCR产物连接入原核表达载体pET-22或pET-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(plySs),获得重组工程菌BL21(DE3)-pET-24-eh,BL21(DE3)-pET-22-eh,BL21(plySs)-pET-22-eh。重组工程菌进行IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:EH在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为BL21(DE3)-pET-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,IPTG浓度为0.4μmol/L,诱导前菌种密度在OD₆₀₀=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的EH蛋白本身无抗凝活性,被FXa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了EH在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高EH的生产效率,为EH的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。     

人β防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定

根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏好,设计引物并通过酶促法合成了人β防御素3(hBD-3)全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体．将表达载体转化Ecoli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达．控制诱导条件,提高可溶性蛋白的表达量．将菌体进行反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白．融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割得到重组人防御素蛋白．用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抑菌活性．     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

猪抵抗素(resistin)的原核表达及表达产物的纯化鉴定

用PCR方法扩增到抵抗素基因(Resistin, RSTN)并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,获得重组质粒pET-RSTN。将重组质粒转化大肠杆菌BL-21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,重组resistin蛋白分子量大小约30kDa。对表达条件如温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化并用SDS-PAGE检测。结果表明,30℃、4h、IPTG浓度为1mmol/L时,可溶性重组resistin的含量最高。表达产物经Western blot检测证实是Resistin蛋白,并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

血管内皮细胞生长因子受体(KDR)的分子克隆与原核表达

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）是特异的血管内皮细胞促分裂素,它主要通过相应受体（ＫＤＲ）刺激血管内皮细胞增殖．ＶＥＧＦ及其受体在肿瘤血管形成中起重要作用．通过逆转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地从人脐静脉内皮细胞扩增出编码ＫＤＲ胞外ＶＥＧＦ结合区的ＤＮＡ片段,将该片段克隆在谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,获得在大肠杆菌Ｊｍ１０９的稳定表达．表达的不溶性融合蛋白可经碱变性法大量提取,为后续的研究工作奠定了基础．     

类橡胶蛋白AbAMP1的重组表达及其抑菌活性研究

将类橡胶蛋白AbAMP1基因克隆至pPIC9,获得重组载体pPIC9-Ab,线性化后转化Pichia pastoris SMD1163,筛选获得阳性转化子.取表型为Mut*的转化子AS16进行诱导表达,上清经Tricine-SDS-PAGE分析,在约4.7 kD处有一条较强主带,与AbAMP1的预期大小相符,表明获得高效表达.上清经酸性非变性电泳后,用凝胶琼脂糖弥散法测定其抑菌活性,在含Bacillus thuringiensis琼脂糖平板AbAMP1对应处有一明显抑菌带,说明重组表达的AbAMP1具有天然活性.上清液抑菌活性试验显示,AbAMP1对Fusarium oxysporum f.sp.cubense以及B.thuringiensis,B.subtilis,Staphylococcus aureus等G 细菌均有显著的抑制作用,而对其它供试丝状真菌、酵母菌以及G-细菌无明显抑制作用.     

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT—PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm—T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因。为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a—SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达。产物经SDS—PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45％左右。Westem—blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应。间接ELISA免疫检测,抗原滴度达1：12500。表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源。     

重组人心房利钠肽 (ANP) 的原核表达、纯化及鉴定

为提高重组人心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)的表达量,将3个ANP通过赖氨酸(Lysine,K)串联,并构建相对应的重组表达载体p ET28a(+)/ANP3。转染大肠杆菌进行诱导表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的60%。经过包涵体变复性,赖氨酸酶(Lys-C)和羧肽酶(CPB)水解,以及一系列层析纯化,每升培养液可获得约16 mg的ANP蛋白。最终,纯化后的ANP经UPLC及Tricine SDS-PAGE鉴定,纯度大于90%,LC-MS鉴定显示其分子量为3 080 Da,且为二硫键正确形成的ANP单体,通过ELISA试剂盒检测,其具有和参比品一致活性。本研究为ANP的大规模制备打下了基础。同时,所采用的串联表达技术也为其他多肽类药物的重组表达提供了新的思路。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

人LRG1基因的原核表达及生物信息学分析

为了探讨LRG1基因结构与功能,对该基因进行克隆并构建到原核表达载体上,并对其进行表达及生物信息学分析。用Trizol法提取人肝癌HepG2细胞总RNA后,PCR扩增得到LRG1片段,经鉴定后将目的基因与原核表达载体pET28a连接,经诱导表达获得His-LRG1蛋白。LRG1基因cDNA片段大小为1 044 bp,编码347个氨基酸;成功构建pET28a原核表达载体,经多次不同条件诱导后,得到大小约40 kD目的蛋白;利用软件对LRG1蛋白的一级、二级结构进行了预测,分析总结得LRG1基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白,可与多种信号开关相互作用。LRG1属于高度保守的富亮氨酸重复家族成员,其原核表达载体不易诱导产生大量目的蛋白,克隆表达该基因有利于验证其结构与功能关系。     

HIV—1gp41基因的高效表达及表达产物的纯化

为了获得高效表达的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）ｇｐ４１蛋白,从而为ＨＩＶ１基因工程诊断抗原的国产化打下基础,用ＰＣＲ的方法从ＨＩＶ１全基因序列中扩增出编码ｇｐ４１Ｎ端的６９０ｂｐ片段。经酶切后,克隆到ｐＥＴ２８ａ载体中,再将重组质粒转化到表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导,高效表达出ｇｐ４１蛋白。间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实,该表达产物具有良好的抗原性和特异性,且表达量约占总菌体蛋白的４５％。重组蛋白经金属鏊合纯化,纯度达９９％。     

猪细小病毒NS1基因的原核表达及重组蛋白的复性

利用PCR技术扩增出PPVNS1基因抗原区。将目的基因与原核表达载体pGEX-4T-1进行连接并转化,重组质粒经鉴定并测序。测序结果表明,目的基因插入的位置、大小和读码框均正确,通过试验摸索并确定了表达NS1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0mmol/L,诱导时间为10h,温度为37℃,其表达量占全菌蛋白的29.8%。表达产物经SDS-PAGE分析,得到分子量约为52kDa的重组蛋白且以包涵体形式存在。重组蛋白经Westernblot检测,结果证明重组蛋白可被PPV阳性血清识别。用8mol/L尿素变性溶解包涵体,再用稀释方法和还原型、氧化型谷胱甘肽系统相结合的方法对重组蛋白进行复性。ELISA检测表明,复性后的重组蛋白有良好的生物活性。