应用RNAi技术治疗HBV的研究进展

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是一种全球性的健康问题。全球大约有4亿HBV慢性感染患者,尤其在中国,感染率高达9.8%。RNAi（RNA interference）技术具有特异性地抑制,甚至关闭基因表达的特点,在治疗HBV感染方面有很大的应用前景。近年来,研究者针对HBV基因设计或筛选有效siRNA靶点做了很多研究,最近还出现了针对与HBV代谢相关的宿主基因设计或筛选siRNA靶点治疗HBV的新策略。该文对RNAi技术在HBV治疗方面取得的研究进展作一综述。     

海蚕新型抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定

摘要：利用巴斯德毕赤酵母表达系统,对海蚕抗菌肽 Perinerin 进行分泌性表达,并进行活性检测。首先通过 SOE 法（Gene splicing by over lap extension）设计三对互补引物来合成完整的Perinerin 的基因,将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPICZαA中,构建了重组表达质粒 pPICZαA-PEN ,转化Pichia pastoris GS115 宿主菌,利用甲醇来诱导外源基因在阳性菌株中的表达,表达产物经 Tricine-SDS-PAGE 电泳验证。生物学活性检测证实重组蛋白对部分革兰阳性及革兰阴性细菌有明显抑制作用,尤其对绿脓杆菌有强烈的抑制作用。     

新型抗菌肽Perinerin在大肠杆菌中的融合表达

为了获得新型抗菌肽 perinerin在大肠杆菌中的高效和可溶表达,实验首先采用SOE 法(重叠 PCR 法)获得的 perinerin 基因序列,对目的基因密码子优化,然后将其连接到 pET32a 载体中获得重组表达载体 pET32a-PEN,通过改变诱导时间和温度、诱导剂 IPTG 浓度以及诱变工程菌株等条件和方法,观察重组蛋白的表达效果,并运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化.SDS-PAGE 显示重组菌诱导后表达的融合蛋白分子量约为 26kD,采用变异重组菌株 MUT 3诱导表达,在 2×YT 培养基培养条件下,30 ℃诱导4 h 可获得高效表达的 perinerin 融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的 50 % 左右,重组蛋白主要以可溶性表达形式存在,可溶性产物最高可达重组蛋白总表达量的 60 %.融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化,纯度可达 90 % 以上.     

多重环介导核酸等温扩增技术检测血液中常见病原体

背景：血液安全性筛查是输血前必要检测项目。目前临床采用血清学检测技术,存在较长的检测窗口期,易产生假阴性检测结果,造成输血交叉感染。目的：建立多重环介导核酸等温扩增技术,实现在一管反应体系内同时检测四种病原体：乙肝病毒,丙肝病毒,艾滋病毒和梅毒螺旋体。方法：通过限制性酶切处理多重环介导核酸等温扩增产物,利用酶切产物的长度分析扩增产物的种类,从而分析待测样本中含有何种血液病原体。结果：检测164例临床样本,其检测结果可以通过琼脂糖电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳及芯片电泳分析,且均可实现对多重扩增产物的酶切片段进行区分和鉴别。结论：多重环介导核酸等温扩增技术可以同时单管检测多种待测血液病原体,可以为临床提高简单、快速、高灵敏和高特异的检测技术。     

南极海洋产耐有机溶剂变性剂氧化剂蛋白酶链霉菌菌株XE-1的初步鉴定及酶学性质

摘要:【目的】从南极海泥土壤中分离得到一株高产蛋白酶的放线菌(XE-1),对所产蛋白酶进行纯化以得到具有特殊性质的酶产物。【方法】通过对XE-1的生理生化和16S rRNA 基因序列分析,初步将其确定为灰红链霉菌的变种。利用乙醇沉淀、离子交换、凝胶等方法纯化后,利用冻干浓缩获得其胞外蛋白酶,用SDSPAGE测定分子量并进行性质表征。【结果】得到一种对高浓度的有机溶剂、变性剂、氧化剂耐受的,表观分子量为14 kDa的碱性丝氨酸蛋白酶,进一步分析,其最适pH 8.2,温度为55℃,米氏常数Km和Vmax分别为1.9 mg/mL和973 u/mL 。此蛋白酶活性于25%的有机溶剂为50%－180%的初始活性;在不同浓度的氧化剂中为110%－140%的初始活性,在0.2 mol/L到4 mol/L的变性剂中表现为100%－150%的初始活性。【结论】从南极海洋链霉菌XE-1中分离得到一种耐有机溶剂、变性剂、氧化剂,大小约为14 kDa碱性蛋白酶,其特殊的酶学性质可用于工业生产或药学等领域。     

重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察

研究重组人内皮抑素突变体质粒HM-E的宿主菌E．coliBL21（DE3）在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性。研究表明,重组人内皮抑素工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性（ST）高,为98％,菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态,反复冻融后表达量未下降,目标蛋白在菌体超声的沉淀中质量分数为（58．75±3．78）％,同时,四甲基偶氮唑盐微量反应比色法（MTT）结果表明目的蛋白质量浓度为20μg／mL时对内皮细胞ECV-304具有很高的抑制率,达（94．72±2．10）％。     

灵芝-8基因的番茄果实特异性启动子植物表达载体的构建

构建含有灵芝-8（LZ-8）基因和番茄果实特异性E8启动子的重组载体,并将其转化到根瘤农杆菌中。通过PCR法获取LZ-8基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI121中,获得果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定,将其转入根瘤农杆菌GV3101中。PCR法、限制性内切酶酶切图谱和序列测定分析均表明番茄果实特异性表达LZ-8蛋白的重组质粒构建成功。获得了含有LZ-8基因和E8启动子的重组质粒,并成功转化根瘤农杆菌,为下一步LZ-8蛋白在番茄果实中特异表达奠定基础。     

酿酒酵母单倍体菌株分离筛选及其产腺苷甲硫氨酸的初步研究

获得产腺苷甲硫氨酸的二倍体酿酒酵母CGMCC 2842遗传育种单倍体亲本。采用不同产孢培养基考察了酿酒酵母的产孢率,并对酿酒酵母CGMCC 2842进行了生孢培养分离子囊孢子得到单倍体菌株,确定单倍体配型,测定不同单倍体菌株腺苷甲硫氨酸含量。从分离的七株单倍体菌株(6株a型和1株α型)中筛选出一株产腺苷甲硫氨酸较高的a配型的单倍体菌株,经250 m L摇瓶发酵48 h后产腺苷甲硫氨酸1.10 g/L。筛选得到了一株产腺苷甲硫氨酸较高a型的单倍体菌株,为菌株的进一步遗传育种改良和腺苷甲硫氨酸微生物发酵法规模化生产奠定了基础。     

海胆黄多糖SEP对S180的体内抑制作用

研究海胆黄多糖SEP对S180肉瘤的抑制作用及初步机制。MTT法检测SEP对体外培养的S180细胞生长的抑制作用;建立小鼠S180肉瘤模型观察SEP抗肿瘤活性;检测SEP协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖作用;同时,考察SEP对NK细胞和杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lym-phocyte,CTL)活性的影响;碳粒廓清检测SEP对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响。研究表明,海胆黄多糖SEP高中低剂量(16、8、4 mg/kg)显著抑制小鼠180实体瘤生长,增加小鼠脾指数和胸腺指数,协同ConA/LPS刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,提高小鼠NK细胞和CTL活性,增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能,通过免疫调节提高小鼠免疫功能达到抑制S180作用。