人黑色素瘤相关抗原Restin的克隆和表达

目的:通过对原核表达载体、表达条件和宿主菌的优化,利用原核表达系统有效表达可溶性的人Restin融合蛋白.方法:应用PCR方法扩增获得Restin编码区,克隆入原核表达载体pET44a(+),分别转化E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3),不同的IPTG浓度诱导表达Restin重组融合蛋白,SDS-PAGE和Western Blot分析表达产物.结果:成功构建了重组载体pET44a(+)-Restin,并在E.coli Rosetta-gamiTM2(DE3)中获得了可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的8.9%.结论:可溶性Restin融合蛋白的获得为后续的功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础.     

人血管生成素基因的优化表达及活性测定

血管生成素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ,ＡＮＧ）广泛存在于多种肿瘤组织中,在肿瘤发生的不同刺激新生血管的形成。利用基因工程技术生产血管生成素,对于研究血管生成素的作用机制及寻找抗血管生成素的药物具有重大价值。倡该基因在大肠杆菌中不能直接表达,本文根据原核翻译起序列的局部二级结构自由能设计了ＡＵＧ上下游序列,并利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人肺癌细胞系Ａ５４９中扩增出起始区改造的ａｎｇ基因,成功构建了人ＡＮＧ的高     

新基因Restin的克隆及比较生物学分析

采用PCR介导的减法杂交技术,从全反式维甲酸诱导的HL-60细胞中克隆得到一新基因,该基因编码219个氨基酸.借助生物信息学分析技术,发现该基因表达蛋白与神经细胞生长抑制因子(Necdin)的功能结构域高度同源(49%),均为碱性蛋白,命名为Restin(细胞静息相关蛋白).更有意义的是,同源搜索发现Restin,Necdin和Mages(黑色素瘤相关抗原家族)为同一蛋白家族,提示Restin和Mages是两类具有某种联系而功能又不同的蛋白质. 对所有这些蛋白进行综合分析发现,它们分别属于两个不同的亚家族,碱性蛋白家族和酸性蛋白家族,其中Restin,Necdin和Mage D1含有碱性同源结构域(理论pI为8.6～10.1), 主要在终末分化细胞中表达,在肿瘤组织极少表达或不表达,实验结果表明,Necdin可以与转录因子(E2F1)及p53相互作用,从而抑制细胞增殖,推测此类蛋白可能与细胞静息状态相关;而Mage A,C等表现为酸性同源结构域(理论pI为4.2～4.9),主要在肿瘤组织和胎儿组织中表达,推测此类蛋白可能与细胞增值有关.这两类蛋白是否构成一对与细胞周期调控相关的正负系统值得进一步深入研究.     

黑色素瘤相关抗原家族新基因restin的组织表达谱

Restin是从维甲酸诱导肿瘤分化细胞中克隆的一种黑色素瘤相关抗原家族(MAGE)的新成员.对该基因在不同组织、不同细胞系的表达水平进行研究,将有利于揭示其生物学功能.使用α3-2P-dCTP标记人restin编码区基因作为探针,针对12种不同成人组织mRNA的Multiple TissueNorthern(MTN)膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple Tissue Expression(MTE)Array膜进行杂交分析,同时利用地高辛标记探针对11种常见肿瘤组织进行原位杂交检测.结果显示,MTN膜杂交中,12种组织显示均一杂交条带,约1.8 kb,提示该基因可能不存在剪接变异体;MTE膜杂交中,正常组织中均有不同程度的表达,但在肿瘤细胞系中均低表达或者不表达;原位杂交的结果显示,在8种恶性肿瘤组织中均不表达,而在3种良性肿瘤组织中呈现较低的表达.结果提示,该基因在正常组织中的表达明显高于肿瘤组织和肿瘤细胞系,完全不同于其它MAGE-A、B、C的组织表达方式.结合该基因在维甲酸诱导分化的肿瘤细胞中高表达,推测restin可能与正常细胞的分化、增殖有关.     

启发式思考题对医学本科分子生物学实验教学的促进作用

目的:通过自行设计的启发式思考题,让问题式学习伴随医学生分子生物学实验教学全程,利用实验课的教学互动环节发挥学生学习的主观能动性。方法:借鉴启发式教学经验和问题式教学方法,在实验的平时考核中增加了启发式思考题,针对教学内容设置拓展性问题,以开卷回答的方式引导学生通过自学寻找操作实践及其理论基础中潜在的知识内涵和科学规律。结果:思考题的引入在强化学生自主学习,锻炼思考和解决问题能力的同时也显示出了良好的区分度。思考题成绩以及以此为基础的平时成绩与实验理论考核成绩之间显示出了显著的相关性。结论:贯穿于实验课教学活动中的启发式思考题在拓展思维、提升学生自主学习能力的同时促进了实验课的教学效果。     

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因. 前期研究表明, 该基因与细胞周期阻滞有关. 由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位, 并且与维甲酸具有诱导关系, 因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关. 将p53转染真核细胞, 研究restin与p53的表达关系. 结果表明p53能诱导restin基因转录增加. 进一步分析发现, restin基因5¢端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点. 扩增该序列构建荧光报告系统, 检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控. 在此基础上, 研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用, 结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关, 推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用.     

人骨保护素成熟肽段基因的克隆和序列测定

人骨保护素（OPG）具有抑制破骨细胞分化、抑制成熟破骨细胞的活性并诱导其凋亡的功能,具有广泛的研究和应用前景。采用RT－PCR的方法从重组骨形成蛋白2（BMP－2）刺激的人骨肉瘤细胞系MG63细胞中克隆编码人OPG的成熟肽段基因,并将其克隆到pUC18中,序列分析结果表明,所克隆的人OPG／OCIF成熟肽段基因与献报道的完全一致。为进一步基因表达及功能研究奠定了基础。     

Cloning and biological comparison of Restin, a novel member of Mage superfamily

In the present study, a new member of melanoma associated antigens (Mage), named Restin (219 amino acids), was identified from HL-60 cell induced by all-trans-retinoic acid (ATRA) by PCR-based subtractive hybridization. Bioinformatics analysis found this novel gene shares high homolog with Necdin (a neuronal growth suppressor, 49%). Both of them are basic proteins. Moreover, the Restin, Necdin and Mages are in one protein superfamily. This fact indicates that the Restin and Mages are mutually related but functionally different. Further analysis found that they can be divided into two subgroups, the acid and the basic. Restin, Necdin and Mage-D1 have an alkaline conserve region (PI is from 8.6 to 10.1), which are not or less expressed in tumor tissues but mostly in normal tissues. It has been reported that Necdin can arrest the cell proliferation by interaction with p53 and E2F1. Therefore, all of them are probably related to arrest the cell cycle. However, the Mage A and C are primarily acid proteins (PI is from 4.2 to 4.9), not expressed in normal tissues but in tumors. It is quite probable that these proteins are involved in the cell proliferation. We therefore suggest that these two protein families might be a pair of control elements of cell cycle--"in cycle or out of cycle".     

Restin与转录因子的相互作用

Restin是从维甲酸诱导分化的白血病细胞中克隆的一种黑色素瘤相关抗原家族基因, 对细胞增殖具有抑制作用. 由于该基因定位于细胞核, 且其同源基因Necdin(神经细胞生长抑制因子)与转录因子p53和E2F1具有强烈的相互作用, 推测Restin也可能作用于某种转录因子. 为此, 克隆了转录因子p53, AP1, ATF和E2F, 研究Restin与这些转录因子的相互作用. 结果发现Restin与ATF3表现出强烈的相互作用. ATF3是细胞应激反应中非常重要的转录因子, 推测Restin对细胞增殖的抑制作用可能与ATF3活性的抑制有关.     

Cloning and biological comparison of Restin, a novel member of Mage superfamily

In the present study, a new member of melanoma associated antigens (Mage), named Restin (219 amino acids), was identified from HL-60 cell induced by all-frans-retinoic acid (ATRA) by PCR-based subtractive hybridization. Bioinformatics analysis found this novel gene shares high homolog with Necdin (a neuronal growth suppressor, 49%). Both of them are basic proteins. Moreover, the Restin, Necdin and Mages are in one protein superfamily. This fact indicates that the Restin and Mages are mutually related but functionally different. Further analysis found that they can be divided into two subgroups, the acid and the basic. Restin, Necdin and Mage-D1 have an alkaline conserve region (PI is from 8.6 to 10.1), which are not or less expressed in tumor tissues but mostly in normal tissues. It has been reported that Necdin can arrest the cell proliferation by interaction with p53 and E2F1. Therefore, all of them are probably related to arrest the cell cycle. However, the Mage A and C are primarily acid proteins (PI