人HPPCn重组蛋白可溶性表达及其增殖活性检测

HPPCn是一种新的肝细胞刺激因子,获得较高纯度的具有生物活性的HPPCn蛋白对研究其生物学功能具有重要意义。HPPCn在重组质粒PET-24a(+)/HPPCn中,诱导表达产物主要以包涵体形式为主。为优化表达条件,运用冷休克表达载体pColdⅡ和无缝克隆技术获得重组质粒pColdⅡ/HPPCn,分别对诱导温度、时间、分子伴侣等诱导条件进行筛选,镍离子柱亲和层析纯化,Western blot分析目的蛋白特异性,不同浓度人HPPCn重组蛋白(0、10、100ng/ml)刺激SMMC7721细胞,免疫细胞化学方法测定Brdu掺入、PCNA表达变化。目的蛋白在培养温度为16℃,终浓度为0.1mmol/L的IPTG过夜诱导时为可溶性表达,最终得到人重组HPPCn蛋白纯度为94.88%,人HPPCn重组蛋白可刺激SMMC7721细胞Brdu掺入增加、PCNA表达水平上调,其刺激作用具有量效关系。通过冷休克表达系统获得可溶性表达的人重组HPPCn蛋白,其具有促进SMMC7721细胞增殖的生物学功能,为深入研究HPPCn的作用机制提供了技术条件。     

基于线粒体基因组控制区序列的中国冰清绢蝶遗传分化和谱系生物地理研究

【目的】分析中国冰清绢蝶Parnassius glacialis遗传多样性和遗传分化情况及其系统发生关系,推测其起源及分歧时间,并探讨其历史生物地理分布格局的成因。【方法】以2008-2016年采集于中国13个地区的冰清绢蝶的325头及绢蝶属其他11个种的11头个体样品,对其线粒体基因组的AT富集区(控制区)序列进行PCR扩增和序列测定,采用MEGA 6.0, Dna SP 5.1和Arlequin 3.5等软件分析其遗传多样性和遗传分化情况;以其他近缘绢蝶种类作为外类群,采用PhyML3.0, MrBayes 3.2和BEAST V1.8.3等软件重建冰清绢蝶的系统发生树,并利用宽松分子钟和校准方法推测中国冰清绢蝶的起源和分歧时间;同时结合现今冰清绢蝶的地理分布特点和第四纪以来的地球环境事件,分析其扩散路径,探讨其历史生物地理分布格局及成因。【结果】冰清绢蝶AT富集区序列长度介于487～495 bp之间,平均为491 bp,其长度的差异主要体现在Poly(T)或Poly(A)的数目差异,A+T平均含量为95.76%。供试冰清绢蝶13个地理居群325头个体中,共检测出基于线粒体基因组AT富集区序列的239个单倍型,单倍型多样性Hd为0.9971;核苷酸多态性指数π值为0.02948, Theta (per site)Eta值为0.06594。系统发生分析和分子定年显示,冰清绢蝶和白绢蝶P.stubbendorfii为近缘姊妹种,二者在距今7.52百万年(Ma)的中新世晚期开始分化。冰清绢蝶的祖先可能起源于我国西南地区(现今横断山脉-喜马拉雅附近的青藏高原东北缘)距今1.53 Ma的更新世时期,先由起源地先期扩散到达小陇山、秦岭一带;后来,由于第四纪的冰期-间冰期轮回事件和扩散路径的不同而分化出2大支系,但两个支系之间存在少量的单倍型相互混杂现象;随后,2大支系继续向低海拔、低纬度地区扩散,即通过伏牛山脉向东北方向扩散到嵩山、泰山、昆嵛山一带,经大别山系向东南方向扩散到琅琊山、紫金山和天目山一带。【结论】中国13个居群的冰清绢蝶没有形成明显的地理分化格局,其遗传变异主要来自居群内部,居群间的遗传分化现象尚不明显;冰清绢蝶起源于更新世时期的较高海拔地区,由于第四纪的冰期-间冰期轮回事件以及扩散路径的不同而形成2大支系并向中国东部和南部低海拔和低纬度地区扩散。