布鲁氏菌vjbR突变株的构建及其毒力表型分析

为分析vjbR在布鲁氏菌毒力中的作用,构建了vjbR的突变株和互补株,并分析了它们在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力。利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了16M的vjbR(BMEII1116)基因,得到了vjbR的缺失突变株16M△vjbR。将vjbR基因的ORF克隆到pMD18-T载体中,然后将其转入到突变株16M△vjbR中得到互补株16M△vjbR-C。用16M、16M△vjbR和16M△vjbR-C侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析它们在巨噬细胞内的生存能力及小鼠毒力。研究结果表明vjbR突变株在巨噬细胞和小鼠体内的毒力减弱,存活能力下降,说明vjbR基因是布鲁氏菌16M的毒力相关基因,对于布鲁氏菌建立慢性感染是必要的。     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株

目的：建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率;方法：采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果：结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论：基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。