羊布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析

分泌蛋白是指那些分泌到细胞外的蛋白质。布鲁氏菌的分泌蛋白可能介导了病原与宿主之间的相互作用, 在布鲁氏菌的毒力方面发挥一定的作用, 但是研究方法的局限性限制了分泌蛋白的研究。本文报道了利用蛋白质组的方法来寻找羊布鲁氏菌的分泌蛋白。首先用TCA-丙酮法提取布鲁氏菌培养上清中的分泌蛋白, 双向电泳进行分离, 然后用质谱来鉴定这些蛋白, 最终鉴定到40种蛋白。通过生物信息学分析, 发现这些蛋白主要是ABC转运系统的底物结合蛋白、外膜蛋白和热休克蛋白。这些蛋白的识别不仅有助于对布鲁氏菌致病机制的理解, 而且也可为     

布鲁氏菌BP26基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立

[目的]由于现有的减毒活疫苗仍存在较强的毒力,因抗原与毒株的差异不大而很难区分疫苗免疫和自然感染等缺点,限制了现有布鲁氏菌减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁氏菌的减毒活疫苗株M5进行遗传改造,克服这些缺点.[方法]本研究利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了布鲁氏菌减毒疫苗株M5的BP26基因,得到了新的标记疫苗株M5△BP26.分别用标记疫苗株和野生株侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析标记株在细胞内和小鼠体内的存活能力.根据种特异性保守基因dnaK和缺失的BP26基因设计引物,建立双重PCR,用于区分标记株与野生株.[结果]成功构建了.BP26基因标记疫苗株,细胞实验和动物实验结果表明,标记株仍能在胞内和小鼠内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.小鼠实验结果显示,感染后两周野生株的细菌数为1022.9 ,而突变株为101.1 (P<0.01),至第3周野生株的细菌数为102.2 ,而突变株未能检出,表明与原疫苗株相比,标记株的感染力进一步减弱.根据DNA序列的差异,建立了能够区分标记疫苗株与野生株的双重PCR方法,标记株因只能扩增出一条带而能与野生株和毒株相区分,从而可以区分自然感染和疫苗免疫.[结论]基因标记疫苗株的构建及鉴别PCR方法的建立,为布鲁氏菌疫苗的进一步研发奠定了基础.     

O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用

突变株的构建是细菌基因功能研究的前提。本研究构建了一个可用于布鲁氏菌突变株构建的自杀质粒。在pUC19质粒的多克隆位点插入卡那霉素抗性基因,在该基因两侧添加多个酶切位点,构建成为pUC19K。利用该质粒,我们构建了布鲁氏菌外膜蛋白Omp25基因的突变株。结果表明,利用该自杀质粒,通过一轮筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。pUC19K质粒的构建及成功应用,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一个快速有效的手段,也为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础。     

布鲁氏菌vjbR突变株的构建及其毒力表型分析

为分析vjbR在布鲁氏菌毒力中的作用,构建了vjbR的突变株和互补株,并分析了它们在巨噬细胞和小鼠体内的存活能力。利用同源重组的方法,用卡那抗性基因替换了16M的vjbR(BMEII1116)基因,得到了vjbR的缺失突变株16M△vjbR。将vjbR基因的ORF克隆到pMD18-T载体中,然后将其转入到突变株16M△vjbR中得到互补株16M△vjbR-C。用16M、16M△vjbR和16M△vjbR-C侵染巨噬细胞和感染小鼠,比较分析它们在巨噬细胞内的生存能力及小鼠毒力。研究结果表明vjbR突变株在巨噬细胞和小鼠体内的毒力减弱,存活能力下降,说明vjbR基因是布鲁氏菌16M的毒力相关基因,对于布鲁氏菌建立慢性感染是必要的。     

布鲁菌抗原的快速克隆与高效表达

目的:通过Gateway技术构建布鲁菌抗原表达载体,并筛选出高效可溶性表达载体。方法:以山羊布鲁菌16M株染色体DNA为模板,扩增4个布鲁菌抗原基因BMEI2002、BMEI1069、BMEI1483和BMEI0748,利用GatewayBP反应将基因克隆到入门载体pDONR201中,构建重组质粒,然后用Gateway LR反应将基因重组到3种表达载体(pDEST17、pHXGWA、pHGGWA)中,构建相应的重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌ER2566(DE3)并诱导表达,分析利用3个不同载体所表达蛋白的表达量及表达形式。结果:利用BP反应构建了4个基因的重组质粒,用LR反应将这些基因分别克隆到表达载体,构建得到了相应的表达载体;诱导表达后的可溶性分析显示,含6×His和TRX标签的pHXGWA所表达的蛋白在表达量和可溶性方面均优于pDEST17和pHGGWA。结论:通过Gateway技术实现了布鲁菌抗原的快速克隆,筛选到的pHXGWA可作为后续大规模克隆表达载体,为布鲁菌抗原的大规模克隆表达和保护性抗原的筛选奠定了基础。     

嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的：建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法：根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果：建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6pg／μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU／mL。结论：建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

靶向宿主致病菌sRNA的发现及其靶标确定的实验技术进展

人类时常暴露于充满各种致病菌的环境中,这些致病菌与人体细胞或组织之间存在多种相互作用。在相互作用的过程中,细菌通过调节自身毒性、侵袭性等致病性,以适应宿主环境并生存下来,同样,宿主细胞也会通过调动自身的免疫系统来抵抗致病菌的入侵。然而,大多数研究者主要聚焦于致病菌sRNA (small RNA, sRNA)自身生理功能的研究,致病菌与宿主相互作用的认识仍然处于起步阶段。因此,如何使用高灵敏性、高分辨率的方法研究致病菌与宿主之间的相互作用成为当前研究面临的一大难题。本文综合国内外相关研究,概述了目前研究致病菌与宿主相互作用常用的技术方法及实验流程,提高对其机制原理的理解,为致病菌sRNA-宿主靶标的相关研究提供技术参考。     

质粒拯救法克隆细菌基因组大片段

[目的]细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点.基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组:DNA的操作提供了方便.本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法.[方法]首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来.最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中.[结果]我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒.将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行.[结论]这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法.