融合蛋白TCRαζβζ中CD3ζ分子与T细胞膜的共定位分析

[目的]构建融合CD3ζ的TCRαζβζ分子的双表达载体,并观察TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜的共定位情况。[方法]设计重叠PCR引物,利用重叠PCR扩增携带荧光蛋白的融合基因TCRβζ-EYFP和TCRαζ,将其克隆到p IRES2-EGFP载体,构建双表达载体p IRES2-TCRβζ-EYFP/TCRαζ,将重组载体分别转染BEL-7402细胞和Jurkat T细胞,转染48 h后,细胞膜经Di D染料染色,共聚焦显微镜扫描并分析该TCRαζβζ分子的表达以及与细胞膜的共定位情况。[结果]重组双表达载体p IRES-TCRβζ-EYFP/TCRαζ经菌落PCR、酶切鉴定及测序分析证明载体构建成功;共聚焦显微镜扫描结果显示重组载体表达了融合蛋白TCRαζβζ分子;共定位程序分析显示TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位关系。[结论]成功构建了融合蛋白TCRαζβζ分子的双表达载体,TCRαζβζ分子中的CD3ζ与细胞膜存在共定位。     

PTD4-GFP-VP3融合蛋白在人肝癌细胞HepG2中的定位观察及凋亡诱导效应的实验研究

目的 观测PTD4-GFP-VP3融合蛋白诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡效应及其在肿瘤细胞中的定位与其凋亡效应关系的研究.方法 构建PTD4-GFP-VP3融合蛋白的原核表达载体,利用人源肝癌细胞株HepG2,经细胞透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白透膜效应,DAPI染色观测该蛋白在细胞中的定位;利用TUNEL法观察PTIM-GFP-VP3融合蛋白诱导肿瘤细胞的凋亡效应,并利用流式细胞仪检测其凋亡率.结果 PTD4-GFP-VP3融合蛋白在孵育细胞0.5 h后即可透过细胞膜进入到细胞质中,12 h后定位于细胞核并诱导肿瘤细胞凋亡,48 h达到最高凋亡效应.结论 PTD4能携带GFP-VP3融合蛋白穿透细胞膜,在肿瘤细胞中具有核定位效应,并能诱导肿瘤细胞凋亡,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础.     

钙结合蛋白CIB1在293T细胞中的表达及亚细胞定位研究

分析和比对钙结合蛋白CIB1在人类、大鼠、小鼠中氨基酸序列差异,并研究CIB1蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位情况。通过Western Blot分析发现293T细胞本身几乎检测不到CIB1的表达。进一步采用CIB1外源性质粒转染,通过免疫荧光分析实验,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间293T细胞中CIB1的表达情况及亚细胞定位变化。实验结果表明,随着转染时间的增加,CIB1在293T细胞中的表达有逐渐增强的趋势,并且发生从细胞核向细胞质的转位现象。该实验结果对了解CIB1亚细胞定位变化及功能研究具有重要参考价值。     

禽流感H5N1病毒感染BALB/c小鼠的细胞免疫动态变化

[目的]测定H5N1病毒感染BALB/c的小鼠模型的细胞免疫动态变化,探讨病毒对机体免疫系统的影响。[方法]通过流式细胞仪测定CD3+T、CD4+T、CD8+T等细胞免疫变化。[结果]感染H5N1病毒的小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞数量下降(P<0.05),脾脏中T细胞数量下降的趋势与血液相同,CD4+T/CD8+T的比例上升,只是两者的时间有所差别。[结论]说明病毒对细胞免疫T细胞数量影响较大,而且CD8+T受到的影响更为明显,反应了机体特异性细胞免疫功能受抑制,并且彼此之间的平衡受到破坏。     

十字花科黑腐病菌III型效应物XopXccR1植物亚细胞定位

[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统（type III secretion system,T3SS）将III型效应物（type III secreted effectors,T3SEs）分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端（1–1220 aa）和C端（1221–2030 aa）分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S：：EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。     

活化/抑制CD59 对T 淋巴细胞增殖的影响

目的：研究活化/抑制CD59 分子对T 细胞增殖的影响。方法：Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59 质粒及用CD59 活化 抗体刺激。激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及CD59 分子在细胞膜上的分布及表达;MTT 比色法检测细胞的增殖。 Western blot检测CD59 分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平。结果：激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿 色荧光,转染效率约为40%。转染pSUPER-siCD59 质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59 分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat 细胞分布一致。抗体活化后CD59 在细胞膜成簇状分布。抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70 的蛋白表达水平均高于正常组 （P<0.05）,而细胞电转质粒后则恰恰相反。结论：CD59 通过与信号转导分子的相互作用促进T 细胞活化增殖。     

α1-肾上腺素受体对胶原诱导性关节炎小鼠Treg细胞功能的影响*

目的: 利用胶原诱导性关节炎 (CIA) 模型小鼠,探讨去甲肾上腺素 (NE) 及其α1-肾上腺素受体 (AR ) 对CIA小鼠Treg细胞的作用。方法: 雄性DBA/1小鼠 32 只,随机分为对照组 (n=8) 和CIA模型组 (n=24)。II型胶原 (CII) 乳剂100 μl 尾根部注射DBA/1小鼠制备CIA小鼠模型,在初次免疫后第 41 日,用免疫荧光法检测小鼠脾脏中CD4⁺T与α1-AR的共定位情况;用Western blot法检测小鼠踝关节和脾脏中α1-AR的蛋白表达。分离纯化CIA小鼠脾脏中CD4⁺ T细胞,用抗CD3和抗CD28的单克隆抗体刺激CD4⁺T细胞,进行细胞培养,分为未加药组和加药组,加药组用NE或α1-AR激动剂苯肾上腺素 (phenylephrine) 处理细胞,用流式细胞术检测CIA小鼠CD4⁺T细胞中Treg的细胞数;用Western blot法检测CIA小鼠CD4⁺T中转化生长因子-β (TGF-β) 和IL-10的蛋白表达。结果: CD4⁺ T细胞能够表达α1-AR;与对照组相比,CIA小鼠踝关节和脾脏中α1-AR的蛋白表达显著降低(P＜0.01);与未加药的CIA小鼠的CD4⁺ T细胞相比,NE加入后的CIA小鼠CD4⁺ T细胞中Treg细胞的功能显著增强(P＜0.01);α1-AR激动剂phenylephrine加入后的CIA小鼠CD4⁺ T细胞中Treg细胞的功能显著增强(P＜ 0.01)。结论: 激活CIA小鼠CD4⁺ T细胞上的α1-AR可增强Treg细胞的功能,促进CD4⁺ T细胞向Treg细胞方向分化,发挥抗炎作用。     

活化／抑制CD59对T淋巴细胞增殖的影响

目的：研究活化／抑制cD59分子对T细胞增殖的影响。方法：Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59质粒及用CD59活化抗体刺激。激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及cD59分子在细胞膜上的分布及表达;MTT比色法检测细胞的增殖。Westernblot检测CD59分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平。结果：激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿色荧光,转染效率约为40％。转染pSUPER-siCD59质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat细胞分布一致。抗体活化后CD59在细胞膜成簇状分布。抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70的蛋白表达水平均高于正常组（P〈0．05）,而细胞电转质粒后则恰恰相反。结论：CD59通过与信号转导分子的相互作用促进T细胞活化增殖。     

NDV诱导HeLa细胞发生核糖体应激及对翻译起始复合体的影响

[目的]研究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV) HBUN/LSRC/F3株(以下简称NDV F3)诱导宫颈癌细胞(HeLa)发生核糖体应激后对eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F的调控作用。[方法]流式细胞术及CCK-8检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测c-Myc基因表达;流式细胞术分析细胞周期;Western blotting技术检测c-Myc、RPS7、Bcl-2、NP、eIF4E及eIF2α蛋白的表达;Western blotting和免疫荧光染色技术检测NP、eIF4E蛋白定位。[结果]与阴性对照组相比,NDV F3抑制HeLa细胞增殖并诱导细胞凋亡。细胞周期中G₀/G₁期出现停滞,c-Myc表达呈时间依赖性抑制,c-Myc与Bcl-2蛋白表达量在0-48 h内逐渐下降,NP蛋白在24 h时生成并逐渐增加,RPS7、eIF4E和eIF2α蛋白含量在0-48 h内呈先增加后降低趋势。Western blotting定位分析及激光共聚焦显微镜结果显示NP蛋白主要存在细胞质中,NP与eIF4E存在共定位现象。[结论]NDV F3诱导HeLa细胞凋亡并引发核糖体应激反应,NP与eIF4E相互作用而抑制eIF2α介导的翻译起始复合体eIF4F形成,阻断其与宿主mRNA之间的联系,同时促进NDV F3 mRNA的翻译,最终造成宿主蛋白翻译抑制。     

应用双光子显微镜和流式细胞仪定性及定量确定小鼠巨噬细胞的吞噬功能

建立了流式细胞仪和双光子激光共聚焦荧光显微镜进行定性和定量检测小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法,并同传统光学显微镜细胞化学染色观察方法相比较,探讨其检测巨噬细胞吞噬效应的优越性。常规方法获取小鼠腹腔和脾脏巨噬细胞,制备巨噬细胞悬液。常规制备鸡红细胞,计数并调整活细胞数,用5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯(5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)染色,与巨噬细胞共温育一定时间后,小鼠巨噬细胞特异性荧光抗体F4/80标记巨噬细胞。应用流式细胞仪检测巨噬细胞中CFSE阳性百分率来表示巨噬细胞吞噬率;应用双光子显微镜观察被吞噬的CFSE阳性鸡红细胞动态分布情况。同时,采用传统光学显微镜吉姆萨染色观察巨噬细胞吞噬百分率。结果显示,流式细胞仪结合双光子显微镜检测巨噬细胞吞噬率与传统的显微镜计数法比较,两者有明显的正相关性。双光子显微镜和流式细胞仪可以定性与定量检测巨噬细胞吞噬功能,该方法具有灵敏、快捷、重复性好以及准确率高的特点,是进行免疫学研究的可行方法。     

肝癌小鼠外周血及脾脏T淋巴细胞亚群的变化及其意义

目的:观察小鼠原位肝癌模型外周血以及脾脏T淋巴细胞亚群与正常小鼠之间的差异变化,探讨其差异变化的意义。方法:在正常KM小鼠肝脏种植H22细胞,建立小鼠原位模型。采用流式细胞术,以健康正常小鼠为对照,检测肝癌小鼠外周血以及脾脏T淋巴细胞亚群的变化。结果:与健康正常小鼠相比,肝癌小鼠外周血CD4~+T淋巴细胞、CD4~+/CD8~+比例有显著性降低,CD8~+T淋巴细胞显著性升高;脾脏CD3~+、CD4~+T淋巴细胞有显著性降低。结论:小鼠原位肝癌模型外周血以及脾脏T淋巴细胞亚群发生异常,免疫系统紊乱,可以反映小鼠肝癌的发生、发展。     

石见穿多糖对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫调节作用

前期研究发现石见穿多糖(polysaccharides from Salvia chinensis Benth.,PSSC)能有效抑制H22肝癌细胞在昆明小鼠体内的生长。在此基础上,本研究进一步探讨了PSSC对H22荷瘤小鼠免疫器官和免疫细胞的影响。通过在昆明小鼠右腋皮下注射H22肝癌细胞构建荷瘤小鼠模型。采用流式细胞术、免疫组织化学染色、酶联免疫法等实验方法评价PSSC对CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)抗肿瘤免疫能力的影响。结果表明PSSC可以有效增加小鼠的脾脏/胸腺指数并促进Con A/LPS刺激的脾细胞增殖。同时,PSSC剂量依赖性地增加了荷瘤小鼠外周血单核细胞、脾脏及淋巴结中CD8+T细胞比例并提高CD8+T细胞与NK细胞在肿瘤组织中的组分含量。注射PSSC后,CD4+T细胞分泌免疫促进因子IFN-γ和IL-2的量增加,而分泌免疫抑制因子IL-4和IL-10的量减少。这一系列实验研究结果表明PSSC具有显著的抗肿瘤免疫增强活性。     

pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白定位于高尔基体

为了明确pten敲除小鼠中转录上调基因pdd87编码蛋白在细胞中的定位,构建PDD87与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白表达载体pEGFP-C1-padS7,利用Lipofectamine2000转染该载体于体外培养的NIH3T3细胞中,采用高尔基体特异探针BODIPY TR C5-Ceramide染色显示高尔基体,激光共聚焦显微镜下观察到PDD87-GFP融合蛋白定位于高尔基体,提示pdd87基因编码的蛋白定位于高尔基体。     

小清蛋白阳性神经元中 ErbB4 免疫荧光染色条件的优化

[目的]探究免疫荧光标记小清蛋白(parvalbumin,PV)阳性神经元中ErbB4的最佳实验条件。[方法]小鼠海马组织,PV和ErbB4做免疫荧光染色,通过激光共聚焦观察多聚甲醛后固定时间、抗原修复和一抗孵育时间对PV和ErbB4免疫荧光检测效果的影响。[结果]多聚甲醛后固定不同时间(8 h、48 h和240 h),一抗孵育40 h,结果显示,随着后固定时间的延长,PV和ErbB4的荧光强度和数量逐渐降低(P0.05)。后固定240 h的脑组织,抗原修复后,PV和ErbB4荧光强度和数量显著升高(P0.05)。一抗孵育12 h检测到PV和ErbB4荧光强度明显低于40 h(P0.05),ErbB4阳性神经元的数量低于40 h(P0.05)。[结论]PV阳性神经元中ErbB4的免疫荧光染色的最佳条件是后固定8 h、一抗孵育40 h。对于多聚甲醛后固定较久的组织,抗原修复能够提高其染色效果。     

小清蛋白中ErbB4免疫荧光染色条件的优化

[目的]探究免疫荧光标记小清蛋白(parvalbumin,PV)阳性神经元中ErbB4的最佳实验条件。[方法]小鼠海马组织,PV和ErbB4做免疫荧光染色,通过激光共聚焦观察多聚甲醛后固定时间、抗原修复和一抗孵育时间对PV和ErbB4免疫荧光检测效果的影响。[结果]多聚甲醛后固定不同时间(8 h、48 h和240 h),一抗孵育40 h,结果显示,随着后固定时间的延长,PV和ErbB4的荧光强度和数量逐渐降低(P0.05)。后固定240 h的脑组织,抗原修复后,PV和ErbB4荧光强度和数量显著升高(P0.05)。一抗孵育12 h检测到PV和ErbB4荧光强度明显低于40 h(P0.05),ErbB4阳性神经元的数量低于40 h(P0.05)。[结论]PV阳性神经元中ErbB4的免疫荧光染色的最佳条件是后固定8 h、一抗孵育40 h。对于多聚甲醛后固定较久的组织,抗原修复能够提高其染色效果。     

小清蛋白阳性神经元中 ErbB4 免疫荧光染色条件的优化北大核心

[目的]探究免疫荧光标记小清蛋白(parvalbumin,PV)阳性神经元中ErbB4的最佳实验条件。[方法]小鼠海马组织,PV和ErbB4做免疫荧光染色,通过激光共聚焦观察多聚甲醛后固定时间、抗原修复和一抗孵育时间对PV和ErbB4免疫荧光检测效果的影响。[结果]多聚甲醛后固定不同时间(8 h、48 h和240 h),一抗孵育40 h,结果显示,随着后固定时间的延长,PV和ErbB4的荧光强度和数量逐渐降低(P<0.05)。后固定240 h的脑组织,抗原修复后,PV和ErbB4荧光强度和数量显著升高(P<0.05)。一抗孵育12 h检测到PV和ErbB4荧光强度明显低于40 h(P<0.05),ErbB4阳性神经元的数量低于40 h(P<0.05)。[结论]PV阳性神经元中ErbB4的免疫荧光染色的最佳条件是后固定8 h、一抗孵育40 h。对于多聚甲醛后固定较久的组织,抗原修复能够提高其染色效果。     

激光扫描共聚焦显微镜研究APOBEC3G蛋白的亚细胞定位

采用RT-PCR技术,从HIV的非允许性H9细胞中获得载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)的全长cDNA。APOBEC3G cDNA全长1 155nt,编码384个氨基酸。将APOBEC3G克隆到真核表达载体pEGFP-C3上,转染CD4 HeLa细胞,激光扫描共聚焦显微镜下可观察到表达的GFP-APOBEC3G融合蛋白定位于细胞质。     

冠状病毒HCoV-229E S1蛋白片段的免疫原性分析

目的表达和纯化HCoV-229E的S1蛋白片段（S1 417-547）,分析其诱导的免疫应答。方法将纯化蛋白免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及血清IL-4和IFN-γ含量,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布,观察其诱导的免疫应答。结果表达蛋白经金属螯合获得纯化,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体。脾脏CD4^＋和CD8^＋比例均升高,CD4^＋/CD8^＋比值下降;免疫鼠血清IFN-γ和IL-4水平显著升高。结论成功构建了HCoV-229E S1蛋白的表达载体,并在BL21（DE3）中得到了高效表达,表达蛋白免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

兔小囊肽对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用

通过腹腔注射地塞米松(DEX)建立小鼠免疫低下模型,探讨兔小囊肽(RSRP)对正常小鼠和免疫低下小鼠的免疫调节作用.采用碳廓清实验、MTT法和流式细胞分析等方法检测小鼠巨噬细胞吞噬功能、脾脏T、B淋巴细胞的增殖以及T细胞亚群.实验结果表明RSRP可以显著提高免疫低下小鼠的脾脏指数(p＜0.01);提高免疫低下小鼠的碳廓清指数k和吞噬指数a(p＜0.01);RSRP还明显拮抗DEX对脾脏T、B淋巴细胞增殖的抑制作用,提高CD4 、CD8 细胞数量,使CD4 、CD8 细胞比值上升(p＜0.01);RSRP对正常小鼠的各项免疫指标也具有一定的促进作用.由此可以看出,RSRP可以明显改善免疫低下小鼠的先天性免疫和获得性免疫功能,具有良好的免疫增强作用.     

荷瘤小鼠脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞数量的分析研究

目的分析荷瘤小鼠与正常小鼠脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞(Tim-3~+/PD-1~+ CD8~+T细胞)的数量比例,预测肿瘤患者功能紊乱型CD8~+T细胞的情况,为改善肿瘤的免疫治疗提供参考。方法设置荷瘤小鼠组与正常小鼠组,每组各3只,分别从两组小鼠脾脏中提取分离获得CD8~+T细胞,用FITC标记的PD-1抗体、PE标记的Tim-3抗体与CD8~+T细胞共孵育,孵育后经流式细胞术检测获得数据,并分析结果。结果正常小鼠组脾脏CD8~+T细胞占脾脏T淋巴细胞总数百分比为7.7%,荷瘤小鼠组脾脏CD8~+T细胞占脾脏T淋巴细胞总数百分比为1.2%,两组的CD8~+T细胞数量有明显差异性(χ~2=0.299,P=0.02);正常小鼠组脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞占CD8~+T细胞总数的百分比为1.17%,荷瘤小鼠组脾脏功能紊乱型CD8~+T细胞占CD8~+T细胞总数的百分比为1.17%,两组数据差异无统计学意义(χ~2=0.00,P=1.00)。结论荷瘤小鼠与正常小鼠脾脏组织中功能紊乱型CD8~+T细胞的数目无明显差异。