小清蛋白阳性神经元中 ErbB4 免疫荧光染色条件的优化北大核心

[目的]探究免疫荧光标记小清蛋白(parvalbumin,PV)阳性神经元中ErbB4的最佳实验条件。[方法]小鼠海马组织,PV和ErbB4做免疫荧光染色,通过激光共聚焦观察多聚甲醛后固定时间、抗原修复和一抗孵育时间对PV和ErbB4免疫荧光检测效果的影响。[结果]多聚甲醛后固定不同时间(8 h、48 h和240 h),一抗孵育40 h,结果显示,随着后固定时间的延长,PV和ErbB4的荧光强度和数量逐渐降低(P<0.05)。后固定240 h的脑组织,抗原修复后,PV和ErbB4荧光强度和数量显著升高(P<0.05)。一抗孵育12 h检测到PV和ErbB4荧光强度明显低于40 h(P<0.05),ErbB4阳性神经元的数量低于40 h(P<0.05)。[结论]PV阳性神经元中ErbB4的免疫荧光染色的最佳条件是后固定8 h、一抗孵育40 h。对于多聚甲醛后固定较久的组织,抗原修复能够提高其染色效果。     

GST-pull down方法鉴定Src激酶与PSD-95的直接结合

脚手架蛋白PSD-95通过募集多种蛋白质在包括缺血性脑中风在内的多种神经系统疾病中具有重要的作用。Src蛋白激酶家族是膜相关非受体酪氨酸蛋白激酶中最大的家族,该家族激酶含有与突触后致密蛋白PSD-95相结合的结构域。Src激酶是其家族中主要成员之一,在脑组织中表达丰富。脑缺血/再灌注引起缺血敏感区Src激酶活性的显著增强。之前的研究表明,Src激酶参与调节PSD-95酪氨酸磷酸化。本实验主要通过GST-pull down实验体外鉴定Src与PSD-95之间的直接结合。     

海人藻酸受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒的构建

目的:构建海人藻酸(kainate,KA)受体GluK2亚基复制缺陷型腺病毒重组体。方法:以GluK2-pcDNA3.1真核表达载体为模板,经PCR扩增GluK2目的基因,然后将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,后将重组的穿梭质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共同电转入BJ5183电穿孔感受态细胞筛选阳性同源重组子。阳性重组体经限制性内切酶PacⅠ消化,经脂质体转染入HEK293细胞进行包装与扩增。接着腺病毒经大量提取纯化后进行滴度测定。结果:GluK2腺病毒具有较强的感染能力(6.75×109ifu/ml)并可表达目的蛋白。结论:GluK2复制缺陷型腺病毒成功构建。GluK2腺病毒可高效感染原代神经元及神经细胞系,为进一步研究其对神经元的调控作用奠定基础。     

酪氨酸蛋白激酶Fyn突变体FynY531F与FynK299M活性的鉴定

Fyn是Src酪氨酸蛋白激酶家族（Src family of protein tyrosine kinases;Src PTKs）中的一员,在神经元的增殖、分化和存活中起着重要作用.本文利用分子克隆手段构建Fyn突变体FynY531F（酪氨酸突变为苯丙氨酸）和FynK299M（赖氨酸突变为甲硫氨酸）的真核表达载体,并通过检测突变体对NMDA受体亚基NR2A的磷酸化作用以鉴定其激酶活性.根据GenBank提供的大鼠Fyn的cDNA序列（NM\--012755）,采用RT-PCR扩增野生型 Fyn（wFyn）目的基因,应用定点突变技术扩增活化型Fyn（FynY531F）目的基因,并用重叠延伸PCR定点突变技术扩增失活型Fyn（FynK299M）目的基因,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+).免疫印迹分析显示,wFyn、FynY531F及FynK299M重组体均能在COS-7细胞表达.将构建的3个重组体分别与NMDA受体亚基NR2A的表达质粒共转染COS-7细胞.结果显示,活化型Fyn能够使NR2A酪氨酸磷酸化,而失活型Fyn则没有表现出激酶活性.结果表明,本文成功构建了野生型、活化型及失活型Fyn的真核表达载体,为进一步揭示Fyn在中枢神经系统中的病理生理意义奠定了基础.     

NMDA受体信号复合体中蛋白质的相互作用

谷氨酸能兴奋性突触的突触后密集区(postsynaptic density,PSD)包含多种受体蛋白、骨架蛋白和信号蛋白,它们通过分子中特定的结构域相互识别并动态地结合,形成多个信号复合体,参与突触后受体功能的调节及其下游特异性信号转导通路的激活。其中,NMDA受体信号复合体中蛋白质-蛋白质的相互作用及其调控机制的阐明,对于深入了解神经发育、突触可塑性、兴奋性毒性等生理病理的分子机制有重要意义。