应用酶联免疫吸附试验(ELISA)快速检测狂犬病毒抗体的研究

国内检测狂犬病毒抗体一直用小鼠接种的方法,尚未见快速检测的研究报道,在建立了狂犬病毒组化免疫酶和免疫荧光方法后,由于防治狂犬病需要更敏感的方法。又建立了酶联吸附试验(ELISA)。 采用新鲜配制的磷酸铝凝胶吸附和释放,结合超速离心来提纯。浓缩组织培养的狂犬病毒,以此作为包被抗原,用辣根过氧化酶标记的SPA为第2抗体,底物为磷苯二胺,作间接ELISA测定小鼠血清中的     

携带EBV-LMP2基因的DNA疫苗、腺相关病毒疫苗和腺病毒疫苗免疫小鼠的特异性细胞免疫应答

细胞免疫应答, 尤其是CD3⁺CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL), 在控制病毒感染中扮演着重要角色. 鼻咽癌(nasopharyngenl carcinoma, NPC)与EB病毒(epstein-barr virus, EBV)持续感染密切相关, 在鼻咽癌疫苗的研究中, 人们将研究重点放在增强特异性抗病毒CTL应答上. 本研究单独或联合使用表达EB病毒潜伏膜蛋白抗原2(epstein-barr virus latent membrane protein 2, EBV-LMP2)的DNA疫苗、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)疫苗、非复制5型腺病毒疫苗(Ad5), 分别于0, 2, 4周肌肉注射免疫4~6周龄的雌性Balb/C小鼠, IFN-γ 免疫斑点法检测EBV-LMP2特异性细胞免疫应答水平. 疫苗诱导的特异性细胞应答水平与疫苗的免疫策略有关. 其中, 使用3种载体疫苗联合免疫的效果最好, 其次则是先使用DNA疫苗免疫两次, 再用腺病毒疫苗加强免疫一次的联合免疫方法. DNA疫苗和AAV疫苗单独免疫能够诱导出特异性的CTL, 但与联合免疫相比诱导的应答水平很低. 结果表明, 使用DNA, AAV和腺病毒载体疫苗联合免疫, 能够更好地诱导机体产生特异性细胞免疫应答, 为鼻咽癌的防治提供了很好的疫苗策略.     

腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配

为研究重组腺病毒载体作为HPV16预防性疫苗的可行性,构建了含密码子优化型HPV 16 L1基因的重组腺病毒,并对优化基因在哺乳动物细胞中的表达进行研究。首先按照哺乳动物密码子偏好对野生型HPV16 L1基因进行改造并合成优化基因,命名为mod.HPV16L1。将mod.HPV16L1基因克隆到穿梭质粒PDC316上,与骨架质粒共转染293细胞,在细胞内包装重组腺病毒rAd-mod.HPV16L1。用免疫印迹法检测病毒感染的293T细胞中HPV16L1蛋白的表达。通过Optiprep密度梯度超速离心法纯化HPV16 L1病毒样颗粒(VLPs)。用磷钨酸负染,在电子显微镜下观察HPV16 L1蛋白自我装配形成的VLPs。结果显示,重组腺病毒载体可介导mod.HPV16 L1基因在哺乳动物细胞内的高效表达,L1蛋白可自我装配形成VLPs。     

替换HIV-1衣壳蛋白基因SHIV的构建及其活性测定

将猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIVmm239)中gag基因的衣壳蛋白部分置换成人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirustype1,HIV-1HXBc2)的相应部分,构建出替换了衣壳蛋白基因的人/猿嵌合免疫缺陷病毒(SHIV)原病毒DNA。用此SHIV原病毒DNA转染293T细胞,细胞中能够检测到嵌合病毒基因的转录与翻译;在细胞培养液上清中亦可检测到装配出的病毒颗粒。病毒颗粒形态正常,含有基因组RNA,具有反转录酶活性,嵌合的外源衣壳蛋白能够正确剪切,形成棒状的核心。将此嵌合SHIV病毒感染MT4细胞,病毒能够吸附并进入细胞,能完成反转录过程,但不能增殖。     

我国北方地区鼻咽癌患者EB病毒LMP1基因缺失分析

为研究我国北方地区鼻咽癌和非鼻咽癌患者Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)基因C端区缺失状况,探讨其在鼻咽癌发生中所起的作用.收集我国东北地区鼻咽癌石蜡组织22例,非鼻咽癌患者外周血26例,提取DNA后,采用聚合酶链反应技术(PCR)扩增LMP1基因的C末端,对其中有缺失的4例鼻咽癌进行了克隆和序列分析.结果显示:22例鼻咽癌组织标本中,有19例扩增出特异性条带,阳性率为86%.其中8例存在缺失,缺失率42%.取4例缺失样品进行序列分析,并与B95-8原型LMP1做比较,结果显示:4例鼻咽癌样品均存在30个碱基的缺失和某些位点的单点突变,并由此引起所编码的氨基酸改变.26例非鼻咽癌患者LMP1阳性扩增率为92.31%,无一例缺失.此结果表明:与广东、广西鼻咽癌高发区相比,我国北方地区鼻咽癌与非鼻咽癌患者中EB病毒LMP1基因缺失型和原型的分布有明显的地区差异.     

IL-15基因佐剂对HIV-1B亚型gp160DNA及腺病毒载体疫苗的免疫效果的影响

本研究构建了IL15质粒以评估其对表达HIV-1gp160的DNA和腺病毒5型载体疫苗的免疫效果的影响。我们构建表达IL15的质粒pVR-IL15,将pVR-IL15联合pVR-HIVgp160初免Ad5-HIVgp160加强方式免疫BALB/c小鼠,用IFN-γELISPOT和ELISA等方法比较疫苗单独免疫组小鼠与疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫和体液免疫反应的强度。结果显示疫苗加IL15佐剂组小鼠诱导的细胞免疫反应和体液免疫反应比疫苗单独免疫组小鼠相均有显著增强。构建的IL15基因佐剂可以增强HIV DNA疫苗初免和腺病毒疫苗加强免疫策略的免疫效果。     

乙型肝-T炎病毒和黄曲霉素协同在裸鼠体内诱发人胎肝细胞癌变的研究

为了研究乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）和黄曲霉素（AFB1）在肝癌发生过程中的作用,用HBV感染人胚胎肝细胞移植至裸鼠背部皮下,以后每周注射AFB1,能诱发裸鼠成瘤,实验分为4组：A组为HV＋AFB1组,即用HBV感染的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,同时注射AFB1;B组为HBV^ 组,用HBV感染的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,不注射AFB1;C组为AFB1^ 组,用不感染HBV的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,注射AFB1;D组为对照组,用不感染HBV的人胚胎肝细胞移植于裸鼠,也不注射AFB1。结果：A组成瘤率为27．3％（6／22）,B组0％,C组13．3％（2／15）,D组0％,所有肿瘤病理诊断均为肝细胞癌。用EMA单抗检测,证实为人来源细胞。PCR和DNA狭缝印迹显示：HBV X和HBV S基因阳性,证明HBV基因已在瘤细胞中。细胞首次用人乙肝病毒协同AFB1在裸鼠体内诱发成功人肝细胞癌,证明了ABV协同AFB1,在人肝细胞癌发生过程中的病因作用。同时,为进一步研究肝癌的发生及防治了良好的动物模型。     

应用蛋白印迹法检测鼻咽癌病人血清中抗Epstein—Barr病毒IgA/EA抗体

曾毅等建立了一系列检测EB病毒IgA/VCA和IgA/EA抗体的鼻咽癌早期诊断方法,取得了满意的结果。为了进一步提高对鼻咽癌诊断更为特异的IgA/EA抗体的检出率,我们建立了检测EB病毒IgA/EA抗体的蛋白印迹法。方法敏感特异,结果令人满意。 本法中所用的两个质粒系由本实验室与西德Pettenkofer研究所Wolf教授的实验室合作构建。pUCARG1140和pUC9MBcE3.2质粒均为表达质粒,前者携带着来源于EB病毒Bam     

应用明胶颗粒凝集试验检测人免疫缺陷病病毒(HIV-1)抗体

明胶颗粒凝集试验是测定HIV-1抗体的新方法。本研究将明胶颗粒凝集试验与ELISA法、蛋白印迹法和间接免疫荧光试验做了比较,观察本方法的敏感性和特异性。共检测了195份来自法国和非洲象牙海岸的血清,凡是蛋白印迹法阳性的血清,明胶颗粒凝试验都是阳性。这表明本方法是特异和敏感的,方法简便,不需特殊仪器,省时,可用于HIV-1抗体的筛选,但多数蛋白印迹法可疑的血清,明胶颗粒试验均阴性。因此,对蛋白印迹法测出的可疑者应该用数种方法进行追踪检测。