从米糠中提取降血管紧张素转换酶抑制剂

采用盐析法提取米糠蛋白,分别选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等单独或联合水解米糠蛋白,以从酶解米糠蛋白中分离获得具有血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性的短肽组分。经Sephadex G-15凝胶层析和SP—Sephadex C-25离子交换层析分离各酶解组分,并检测各组分的ACE抑制活性。结果表明,米糠蛋白的酶解分离产物中含有较强ACE抑制活性的组分,其中经胃蛋白酶和胰蛋白酶共同水解时得到的小分子量寡肽组分的抑制活性最强,为后续对其进行结构分析奠定了基础。     

两种菌株来源的glyA基因的克隆、表达及酶活性检测

采用PCR方法,分别从大肠杆菌和嗜热链球菌基因组DNA中扩增获得glyA基因,分别克隆入载体pET-28 a(+)中并进行表达,分离和纯化得到两种不同来源的SHMT,分别检测两种SHMT的逆向酶活。比较来源于大肠杆菌K12与嗜热链球菌AS1.2471中的glyA基因表达的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的活性,以获得高活性的SHMT。结果成功获得两种菌中的glyA基因,并表达出具有较高活性的SHMT,其中嗜热链球菌中glyA基因表达出的SHMT的酶活性大约为大肠杆菌的两倍。从嗜热链球菌中克隆表达的SHMT具有更高的催化活性及良好的工业应用前景。     

ADA-LacZ融合基因直接注射导入小鼠皮肤组织后的表达

将ADA－LacZ融合基因经直接注射导入小鼠皮肤组织,用注射点处的皮肤组织制作冰冻切片,经组织化学方法显示：此融合基因可在皮肤成纤维细胞中表达一种具有腺苷脱氨酶（ADA）和β-半乳糖昔酶（β-gal）双重酶活性的融合蛋白,这种直接将融合基因导入体内进行表达的方式．为在基因治疗和基因疫苗研究中探索一条新的简便可行的外源基因在体内表达的途径,提供了有益的实验依据。     

极低密度脂蛋白对巨噬细胞载脂蛋白E基因表达的调节

巨噬细胞（M）是动脉粥样硬化（AS）斑块中泡沫细胞的主要来源之一,它可通过其表面的多种脂蛋白受体介导摄取合APOB或APOE的脂蛋白,导致M的脂质增加．此外,M有较强的分泌ApOE的能力[1],这一现象虽已发现多年,但意义尚不清楚VLDL是一种含APOE的脂蛋白,它能通过M膜上识别APOE的受体进入M,从而促进Mg内脂质堆积,并与AS密切相关[2,3]．流行病学调查发现在我国的高脂血症中2／3为VLDL升高为主的高甘油三酯（HTG）血症．另外,Evans等报道HTG血症患者的血浆中以ApoE－poorVLDL升高为主,它们在血浆中清除的速率较Apo…     

6His-VP3融合蛋白的表达、纯化及其捕获细胞中相关蛋白的初步探讨

目的 研究人肝癌细胞HepG2与人胎肝细胞L-02中与VP3蛋白相互作用的蛋白组分,以探讨VP3特异性诱导肿瘤细胞凋亡的机制。方法 采用PCR方法克隆vp3的DNA片段,将其插入质粒pET-28a（＋）构建含6个组氨酸标签6His-VP3融合蛋白的原核表达载体。利用亲和层析技术制备纯化的6His-VP3融合蛋白作为诱饵,分别从肿瘤细胞HepG2及正常细胞L-02的总蛋白中,通过pull-down技术捕获与VP3相互作用的特异性蛋白质组分。结果获得了高纯度的6His-VP3融合蛋白;以其作为诱饵从HepG2细胞和L-02细胞中捕获到的与VP3作用的相关蛋白质组分存在差异。结论 肿瘤细胞HepG2及正常细胞L-02中,与VP3作用蛋白的差异与其在不同细胞中的生物学行为相对应。     

蛋白G IgG Fc段结合域的克隆表达及功能研究

旨在研究蛋白G IgG Fc段结合域(PGFB)的克隆、表达及其抗体结合功能,用于抗体的纯化.根据PGFB的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成了4个寡核苷酸片段.通过重叠延伸PCR方法合成了PGFB DNA片段,测序鉴定后克隆至原核表达系统pET-28a-c(+)上,转化大肠杆菌,获得表达菌株;IPTG诱导表达PGFB,经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化后偶联到琼脂糖凝胶6B上,用其纯化多克隆抗体.结果显示,PGFB在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,纯化后纯度达到90%以上,相对分子量为12.25 kD,与预期值相符.此外,偶联产物纯化多克隆抗体达到了良好的效果,每毫升基质可结合20 mg抗体.本研究克隆构建并高效表达了具有较好抗体亲和能力的PGFB,为多克隆抗体的快速纯化提供了方便.     

VLDL—受体重复序列的诱变缺失与配体结合力的关系

极低密度脂蛋白受体 (VLDL R)的配体结合域上存在 8个富含半胱氨酸的重复序列 (ligand bindingre peats,LBR) ,被认为是与配体结合的部位。该受体与含 7个类似重复序列的低密度脂蛋白受体 (LDL R)配体结合特性明显不同。为了明确VLDL R中 8个LBR在与配体结合中的作用并探讨VLDL R与LDL R结合特性差异原因 ,采用基因缺失诱变方法 ,构建了各种不同重复序列缺失的VLDL R重组体。将其分别导入无LDL R功能性表达的ldl A7细胞。转染细胞与荧光标记的VLDL、β VLDL及LDL的结合实验结果表明 ,LBR1和LBR2对结合富含apoE的脂蛋白 (VLDL ,β VLDL)最为重要 ;LBR3和LBR6对结合VLDL也有重要作用 ,但对结合 β VLDL无明显影响。结果同时表明 ,LBR7缺失的VLDL R表现出部分LDL R的结合特性 ,提示该重复序列可能是VLDL R与LDL R配体结合特性差异的部分原因     

利用复感儿T淋巴细胞作为外源性ADA基因表达效应细胞的实验探讨

对４１例健康儿童和１７例反复呼吸道感染患儿（复咸儿）的外周血淋巴细胞ＡＤＡ活性进行了检测．两例ＡＤＡ活性明显低下的复感儿的外周血Ｔ淋巴细胞被选作实验样品,经体外培养后,采用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导的的方法导入外源性ＡＤＡ基因．结果表明：体外培养的两例复感儿淋巴细胞中ＡＤＡ活性较基因转移前升高;细胞免疫学特性也在一定程度上获得改善     

电穿孔导入的LacZ基因在人肺癌细胞中的表达

选用LacZ基因作为报告基因,用电穿孔法与pSV2neo质位共转化导入人肺巨细胞癌高转移细胞株,经G418及X－gal组化法双重筛检,获得LacZ基因表达阳性的细胞克隆。经X－gal组化染色,该克隆70％细胞蓝染,再经软琼脂培养后,形成的集落蓝染率约为65％,单个集落中的细胞蓝染率可达100％,在裸小鼠皮下或尾静脉接种这一LacZ基因表达阳性的克隆细胞后,在形成的肿瘤及肺内转移灶的冰冻切片中,X－gal染色可观察到蓝染的癌细胞。但由于细胞周期不同步、遗传稳定性以及表达调控因素的影响,则可能是本实验中部分细胞染色阴性的原因。我们的实验表明,LacZ基因有可能在肿瘤转移的研究中作为一种理想标志基因。     

全长及缺失VLDL受体基因转染的CHO细胞与β-VLDL的结合效应

为探讨 VLDL受体结合域中 8个重复序列在结合 VLDL中所起的作用 ,利用构建的全长VLDL受体 c DNA和缺失 5个重复序列的该受体 c DNA重组表达载体分别导入 CHO细胞中 .RT- PCR可检测到外源性 VLDL受体基因的表达 .受体与配体结合研究表明 ,转染全长 VLDLR重组体的 CHO细胞结合β- VLDL的能力明显高于转染 VLDLR缺失重组体的 CHO细胞 ,表明人VLDL受体在 CHO细胞中能有效表达 ,而缺失 5个重复序列的 VLDL受体基本失去了结合β-VLDL的能力