甲型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞核酸增殖培养模型的建立

目的采用人胚肺二倍体细胞(2BS细胞)培养,结合实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测,开展甲型肝炎病毒(HAV)在2BS细胞核酸增殖培养模型的建立研究。方法将不同浓度的HAV活病毒感染2BS细胞,分别于感染后0、8、10、14、20 d收获HAV感染的细胞,应用已建立的HAV核酸检测和抗原检测方法分别检测HAV病毒核酸含量和抗原含量的动态变化。结果 HAV在2BS细胞中可有效复制和扩增,高剂量组以1×10~4 CCID_(50)/mL HAV感染0 d即可检测到HAV核酸,10～20 d病毒核酸达到峰值7.607 lg copies/μL;中剂量组以1×10~2 CCID_(50)/mL HAV感染6 d可检测到HAV核酸,6～10 d病毒增殖明显(P0.05),14～20 d病毒核酸含量达到峰值7.074 lg copies/μL并趋于稳定;而低剂量组以1 CCID_(50)/mL HAV感染后,10 d HAV开始增殖,20 d病毒核酸含量与中、高剂量组别相近且基本达到峰值;当HAV感染2BS细胞10 d时,病毒核酸检出拷贝数与感染HAV浓度呈良好的线性关系,可根据标准曲线准确反映样品中的HAV活病毒含量。细胞培养结合病毒抗原表达也可有效反映HAV的扩增情况,但较病毒核酸的出现呈明显滞后,且当样品中抗原含量低时,至少需要20 d以上才可完全检测到病毒抗原的表达。结论应用2BS细胞培养和qRT-PCR检测建立了2BS细胞HAV核酸增殖模型,可快速、准确地反映HAV活病毒在细胞中的动态感染和增殖情况,可应用于HAV活病毒的快速定量、病毒特性、药物筛选和疫苗评价等相关研究。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

重组禽腺联病毒介导的miRNA抑制传染性法氏囊病病毒在鸡胚内的复制

【目的】在鸡胚水平上探索VP1和VP2基因特异miRNA抑制传染性法氏囊病病毒(infectious bursaldisease virus,IBDV)复制的可行性。【方法与结果】将表达VP1基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP1或VP2基因特异miRNA重组载体pAITR-RFPmiVP2E与禽腺联病毒(avian adeno-associated virus,AAAV)包装载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞,获得重组病毒rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E,用同样方法获得不表达miRNA的rAAAV-RFP和表达对照miRNA的rAAAV-RFPmiVP2con。电镜观察显示重组病毒具有典型的AAAV颗粒形态;PCR检测结果表明其基因组中含miRNA表达盒;经poly(A)加尾RT-PCR检测证明重组病毒感染细胞能表达基因特异的miRNA。分别将重组病毒经卵黄囊途径接种8日龄SPF鸡胚,然后经绒毛尿囊膜途径用Lukert株IBDV攻毒,收获鸡胚进行IBDV组织细胞半数感染剂量(TCID50)测定。结果在攻毒后第3天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的IBDV TCID50分别下降到1.0和1.5 log10;在攻毒后第6天,rAAAV-RFP和rAAAV-RFPmiVP2con接种组的IBDV TCID50仍为8.0 log10,rAAAV-RFPmiVP1和rAAAV-RFPmiVP2E接种组的TCID50分别下降到0.8和2.0 log10。【结论】rAAAV是有效的miRNA鸡胚导入载体,表达的VP1和VP2基因特异miRNA能有效阻断IBDV复制。     

通过基因组定量研究猪瘟病毒在细胞中的增殖特性

应用间接免疫荧光、Real-time PCR和病毒感染滴度(TCID50)测定技术,分别从病毒抗原、病毒基因组RNA复制水平和病毒感染滴度变化3个方面,研究了猪瘟病毒(CSFV)在PK-15细胞中增殖的特点,用猪瘟病毒石门株感染96孔板培养的细胞,1×102个TCID50/孔,间接免疫荧光检测结果显示感染后8h能检测到被荧光抗体染色的感染细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染后72h,几乎所有细胞均能出现荧光。Real-time PCR结果显示在细胞感染初期的8~24h,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,其拷贝数在感染后72h达到高峰。此外,在感染后8h能检测到病毒基因组负链RNA转录,不过负链RNA在病毒增殖过程中维持在较低的水平。TCID50测定结果表明CSFV的感染滴度增加趋势与基因组类似,在病毒感染8h后能检测到具有感染性的子代病毒,感染滴度在8~20h之间逐渐增长,24~48h之间增长速度稍减慢,在感染后48~52h达到高峰,能在72h之内维持较高的感染滴度。     

狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法的建立

建立狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法,并进行评价和初步应用。针对狂犬病病毒L基因保守区域设计特异性引物、探针,建立PCR反应体系并评价检测体系的扩增效率、灵敏度、特异性和准确性等指标,灵敏度评价结果与现有巢式RT-PCR和基于N基因qRT-PCR检测方法相比较。结果显示本研究建立的基于L基因qRTPCR检测体系扩增效率高于90%;最小检测病毒滴度为2.7×10~(-3)FFU/mL,灵敏度高于基于N基因qRT-PCR和巢式RT-PCR 100倍;最小检测核酸拷贝数为100拷贝,建立了基于目的基因RNA标准品的标准曲线,可用于定量检测;对于我国的狂犬病病毒流行毒株检测范围较广,动物样本检测结果与金标准DFA检测结果相一致,准确性较高。本研究建立的狂犬病病毒qRT-PCR可用于狂犬病病毒实验室检测。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

犬2型腺病毒E1转化细胞系的特性研究

对筛选到的一株CAV—2 E1转化细胞(DK／E1)进行了初步的特性研究。以DK细胞为对照,观察到转化细胞的形态与DK细胞有明显区别,细胞变长,易聚集生长。通过测定DK及DK／E1细胞分别在2％、5％和10％牛血清培养基中的生长曲线,结果发现DK／E1细胞的生长速度比DK细胞快。用蚀斑和TCID50测定了病毒在DK和DK／E1细胞上的病毒滴度,结果表明DK／E1细胞产生的病毒蚀斑比DK细胞的大,TCID50测得的病毒滴度比DK细胞产生的病毒滴度高。CAV—2全基因组DNA对DK／E1细胞和DK细胞的转染试验结果表明,5μg和10μg的CAV—2 DNA转染的DK／E1细胞,分别在转染后第14天和第11天均出现了典型的腺病毒细胞病变,而相同量CAV—2 DNA转染的DK细胞未出现病变,说明DK／E1细胞有助于CAV—2 DNA的复制和病毒粒子的包装。在DK／E1细胞内的重组试验表明,DK／E1细胞也有利于重组病毒的产生。以上转化特性在DK／E1细胞传至80代时仍保持不变,说明本试验获得了一株CALV—2 E1基因的转化细胞系。     

实时定量RT-PCR检测鱼类传染性造血器官坏死病毒方法的建立与应用

建立了Taqman 实时定量RT-PCR方法检测传染性造血器官坏死病毒(IHNV).选取IHNV病毒的N蛋白基因保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针.以梯度稀释的含有IHNV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量RT-PCR反应以确定检测灵敏度.病毒浓度在5×106 -5个拷贝,共7个数量级的范围内,定量RT-PCR反应有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为5个拷贝.根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线.该方法具有特异性,对鲤春血症病毒(SVCV)、病毒性出血性败血症(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、EPC细胞系、牙鲆的核酸都没有扩增反应.在50批待检样品中,有3批鱼类感染IHNV,利用标准曲线进行了定量分析.实时定量RT-PCR检测IHNV方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在鱼病的快速检测上具有重要意义.     

十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.     

埃博拉病毒莱斯顿亚型实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究的目的为建立一种灵敏、快速、定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。首先选择埃博拉病毒莱斯顿亚型的保守基因NP基因作为检测靶目标,筛选出保守序列并设计合成一对特异性引物。然后将连有NP全长基因的重组质粒作为定量标准品,将10倍系列稀释的重组质粒进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、灵敏度及特异性检测。结果显示建立的埃博拉病毒莱斯顿亚型荧光定量PCR检测方法,其灵敏度可达102拷贝/μL,不同梯度标准品间线性关系(R2)达0.997,斜率为-0.3101,扩增效率为110.145%,所有标准品均在79.94℃出现尖且窄的特异性熔解峰。利用该检测系统可以快速定量检测埃博拉病毒莱斯顿亚型核酸,灵敏度高、重复性好,可用于基础及临床实验室对埃博拉病毒莱斯顿亚型感染的快速诊断和临床效果的监测,具有实际的应用价值。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

PK-15细胞微载体悬浮培养生产猪细小病毒的工艺研究

通过对猪细小病毒接毒时间TOI、MOI和收毒时间进行优化,开发了一种基于PK-15细胞静置培养的猪细小病毒生产工艺,最大病毒滴度达到107.5TCID50/ml。通过进一步优化接毒时间,成功建立了基于PK-15细胞反应器微载体悬浮培养的猪细小病毒培养工艺,在5L反应器上最大病毒滴度达到107.2TCID50/ml。首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度的正相关性,当猪细小病毒滴度处于最大值时,乳酸对葡萄糖得率也达到最大值,可作为指针病毒滴度及收毒时间的重要参数。     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

云南省甲属披膜病毒的特性

从云南省分离的甲属披膜病毒,在蚊、鼠、猴等多种动物细胞和人细胞中均能增殖,并能在营养琼脂覆盖的鸡胚细胞和Vero细胞中形成空斑;在小白鼠体内具有组织泛嗜性;在蔗糖中的浮力密度为1.17g/cm~3。体内外试验都表明,该病毒增殖速度快。用低滴度(4.0 log TCID50)或高滴度(7.0 log TCID50)病毒,脑内或皮下注射乳鼠均能稳定致死,唯低滴度者的潜伏期略长于高滴度者。3周鼠脑内或皮下注射病毒虽不死亡,但在体内能检测出病毒及特异性抗体。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

蜱传脑炎病毒对人单核细胞的致病性北大核心CSCD

【目的】确定蜱传脑炎病毒(Tick-born encephalitis virus,TBEV)对人单核细胞的感染性及对其复制增殖的影响。【方法】用蜱传脑炎病毒感染单核细胞THP-1,观察细胞病变情况。取不同时间点的细胞培养上清,测定病毒滴度,并用Real Time RT-PCR方法检测病毒核酸;用流式细胞法检测细胞感染率,以确定TBEV在THP-1细胞中的复制增殖情况;同时进行细胞活力检测,以确定TBEV感染后THP-1细胞的变化。【结果】TBEV病毒感染THP-1细胞后,可进行复制增殖,流式细胞法可检测到细胞内的病毒,感染病毒后的单核细胞活力显著降低。【结论】TBEV可在单核细胞THP-1中复制增殖,并可造成细胞活力的显著降低,提示单核细胞可能在TBEV感染机体并扩散至各组织器官过程中发挥了重要作用。     

犬细小病毒可视化LAMP检测方法的建立

目的:建立犬细小病毒(CPV)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法。方法:比对77个不同犬细小病毒全基因组数据,从中找出一段433 bp的高度保守序列作为检测对象,通过基因合成得到含该序列的质粒,制备1×10~3、1×10~2、1×10~1拷贝/μL的质粒作为标准品,并设计一套能扩增这段序列的LAMP引物。结果:首先采用实时荧光定量LAMP扩增,确定了设计的引物能够扩增质粒标准品,最低检测浓度为1×10~1拷贝/μL;然后用pH敏感指示剂中性红进行可视化LAMP扩增检测,肉眼观察到扩增反应液变为紫红色即判断为阳性,最低检测浓度同样为1×10~1拷贝/μL;随后采用实时荧光定量LAMP和可视化LAMP测试50份犬细小病毒疑似临床DNA样品,检测出阳性样品35个,与国标诊断结果完全吻合;将阳性样品扩增后测序,经比对,确定为犬细小病毒序列;对金黄色葡萄球菌、宋内志贺菌、坂崎肠杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌DNA进行扩增,结果均为阴性,证明了该方法的特异性。结论:建立了高度特异和灵敏的犬细小病毒可视化LAMP检测方法。     

细胞培养结合实时荧光RT-PCR法快速检测甲肝病毒滴度的研究

目的建立一种细胞培养与实时荧光RT-PCR相结合的快速检测甲肝病毒滴度的方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株5'端基因组序列,设计了2条基因特异性引物及一条探针,建立实时荧光RT-PCR法,结合细胞培养检测甲肝病毒滴度,并与ELISA检测法进行比较。结果实验中建立的方法能特异检测甲肝病毒,细胞培养8d检测病毒滴度为lg107.0CCID50/mL。同一样本重复检测3次,批内样本Ct值的变异系数最大为0.89%,批间样本Ct值变异系数最大为1.66%。建立的细胞培养结合实时荧光RT-PCR法(细胞培养8 d)与细胞培养ELISA法(细胞培养28 d)检测甲肝病毒滴度结果差异无统计学意义(P0.05)。结论该方法具有快速、灵敏、特异等优点,应用于疫苗常规检测有良好前景。     

牛副流感病毒3型的分离鉴定

从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离到1株病毒, 该病毒能在MDBK细胞上增殖并产生特征性细胞病变, 对分离毒株进行理化特性、RT-PCR鉴定及序列测定与分析, 结果发现该病毒为RNA病毒, 具有血凝性, 对乙醚、氯仿极其敏感, 不耐热, 对酸的抵抗力差; 分离株与GenBank中已发表的病毒株N基因片段的同源性为82.6%~99.1%, 结果表明分离的病毒为牛副流感病毒3型毒株, 命名为BPIV3 DQ1株。根据GenBank上发表的牛副流感病毒3型核衣壳蛋白N基因序列, 设计合成了一对特异性引物, 能扩增704 bp的目的片段, 可以检测出10个 TCID50/100 μL病毒核酸。     

人3型副流感病毒滴度TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的利用TaqMan实时荧光RT-PCR(real-time RT-PCR)技术建立测定人3型副流感病毒培养物滴度的方法。方法根据人3型副流感病毒HN基因的保守序列设计引物及探针,采用10倍系列稀释的体外转录HN RNA为模板,建立定量标准曲线。验证方法的专属性、敏感性、重复性,并对人3型副流感病毒的病毒培养液滴度进行检测。结果建立的方法对HN RNA标准品的检出灵敏度为4.7 copies/μL,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为105%。标准品的实验内重复性CV均0.50%,实验间重复性CV3.60%。系列稀释HNRNA标准品在低温(-80℃)下保存3年后,所测标准曲线的斜率和截距差异均无统计学意义(P=0.673)。用该方法对人3型副流感病毒分离株LZ17、LZ1501和LZ1728进行检测,结果均为阳性,3个病毒分离株滴度检测重复性CV均10.00%;对7种呼吸道非人3型副流感病毒病原体检测均为阴性,表明该方法具有很高的专属性、敏感性和重复性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确地对人3型副流感病毒滴度进行检测。