互花米草群落功率最大化倾向

植物新种进入新区域后,通过扰动或搅局,改变生态系统的结构,形成有特色的自组 织生态系统,趋向新条件下的功率最大化.本文应用能值分析的方法,分别对苏北互花米草 生态系统和光滩生态系统进行能值分析和系统评估.结果表明：互花米草生态系统每年能值 产出比光滩生态系统高1.52E+18 sej.能值密度是光滩的4.72倍,基础能值产出率约为光滩生态系统的5倍.互花米草生态系统能更有效地利用能量,增加系统内部的 能值贮存,实现系统内部的功率最大化.互花米草入侵某区域滩涂后,通过自组织促使整个互花米草生态系统趋于功率最大化,充分发挥生态服务功能,但由于其繁殖扩散过快,导致种群爆发,产生了一系列负面效应,如抑制本土物种、侵占航道、危害贝类养殖等.     

EV71 3C蛋白酶与ZMYM2相互作用及功能初探

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属A组病毒的代表株,感染可引发手足口病(Hand-foot and mouth disease,HFMD),严重危害儿童健康.EV71 3C蛋白酶(3C)是其编码的主要蛋白酶之一,在病毒多蛋白加工过程中发挥关键作用,同时切割细胞蛋白以利于病毒复制.为进一步了解EV71与宿主间博弈关系,本课题组前期以3C为诱饵进行酵母双杂交实验,筛选与3C发生相互作用的可能底物,钓取到锌指MYM型蛋白2(Zinc finger MYM-type protein 2,ZMYM2).ZMYM2是一种具有锌指结构的转录因子,与细胞中重要的抗病毒小体PML核体(PML nuclear bodies,PML-NBs)的形成及稳定性相关.本文选择3C与ZMYM2关系展开研究,确证二者相互作用并初探生物学功能.首先通过免疫共沉淀实验确证3C与ZMYM2之间存在相互作用;随后分析功能,发现过表达ZMYM2抑制EV71复制;敲减内源ZMYM2有利于EV71的复制;分析3C对ZMYM2影响,发现3C剂量依赖性切割ZMYM2,ZMYM2上至少具有2个3C的识别位点.本研究为解析ZMYM2功能及进一步了解EV71与宿主先天免疫间博弈关系提供了新的实验证据.     

蓝舌病病毒基因节段2与6的重配导致病毒血清型与增殖特性的改变

【背景】蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)是一种侵染反刍动物的虫媒病毒,基因重配可引起病毒的快速变异。【目的】通过我国强致病性BTV-16型毒株与弱致病性BTV-4型毒株间Seg-2与Seg-6基因节段的重配,探讨病毒基因重配与表型变异之间的关系。【方法】采用全长cDNA扩增与高通量测序获取BTV-16/V158的全基因组序列,构建病毒的真核表达质粒,通过免疫荧光与WesternBlot检测目的蛋白表达;通过RT-PCR、体外转录与细胞转染等方法建立BTV反向遗传体系并获取基因重配病毒;通过蚀斑分析、增殖曲线分析与血清中和试验,比较亲本毒株与基因重配病毒在生物学特性上的差异。【结果】获取的BTV-16/V158毒株基因组大小为19 186 bp,与中国和印度BTV-16型毒株具有最近的亲缘关系;将表达BTV VP1、VP3与NS2的真核表达质粒转染细胞,检测到目的蛋白的表达;将BTV的7种真核表达质粒与基因组ssRNA共转染BHK-21细胞,成功拯救出与亲本毒株生物学特性一致的病毒;将BTV-16/V158毒株的Seg-2与Seg-6替换为BTV-4/YTS4毒株的对应基因节段,拯救出基因重配病毒BTV-16/V158-RG (BTV-4/S2,S6);与亲本病毒相比较,基因重配病毒在BHK-21细胞上形成的蚀斑变小,增殖能力减弱,血清型由BTV-16型转化为BTV-4型。【结论】建立了我国流行BTV-16型毒株的反向遗传体系,BTVSeg-2与Seg-6的基因重配可引起病毒在细胞上增殖能力的改变与血清型改变。研究结果为BTV基因重配致病毒变异与新型基因工程疫苗的研究提供了基础。     

首次在云南省哨兵牛上分离出一种新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)为环状病毒属新成员,2009年首次在西藏墨脱县多斑按蚊中发现,目前该病毒对动物健康和公共卫生的危害尚不清楚,本文首次报道了牛体上一株新型TIBOV的分离.2019年在云南省景洪市设置哨兵牛3头,每周采血进行虫媒病毒的监测与病毒分离.监测期的第4周,其中一头牛采集的血液样本接种C6/36细胞盲传3代出现细胞病变,提取病毒核酸进行琼脂糖凝胶电泳,显示病毒基因组为10节段双链RNA,呈"3-3-3-1"的带型特征.电镜观察可见直径约70nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征的病毒粒子,将分离的病毒命名为V298/YNJH/2019.对决定环状病毒种属的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)序列分析显示,分离毒株的Seg-3/T2与其它TIBOV毒株的核酸(nt)与氨基酸序列(aa)相似度分别在79.6％～79.9％与96.3％～96.4％之间,其T2蛋白在系统发生树上与其它TIBOV聚为一簇;对决定病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,分离毒株与其它TIBOV毒株Seg-2/OC1的序列相似度分别在42.3％～43.4％(nt)与29.3％～31.7％(aa)之间,其OC1蛋白形成独立于其它TIBOV毒株的进化分支,以上结果提示V298/YNJH/2019为一种新血清型TIBOV.通过实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验,对病毒在牛上感染特征的回溯分析显示:在分离到病毒的前一周,动物血液中可检到低水平的病毒核酸,在分离到病毒的当周,血液中病毒核酸含量处于高峰,但两周后检测结果为阴性;动物在病毒感染后第2周开始产生中和抗体,在随后两周达到高峰,在感染后4个月仍保持较高水平.本研究首次报道了一种新型TIBOV在牛体上的分离,丰富了我国流行TIBOV多样性与感染特性的认知,为TIBOV的流行病学、致病性与诊断试剂的研究提供了基础.     

十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.     

中国蓝舌病病毒流行株血清型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,我国存在12种血清型BTV (BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21和-24)的流行。【目的】建立12种血清型BTV的RT-qPCR定型方法,为BTV的诊断与流行病学研究提供技术保障。【方法】根据我国流行BTV基因节段2 (Seg-2)序列设计引物和TaqMan探针,对引物的特异性与敏感性进行评估;以12种血清型BTV毒株和核酸阳性血液样本验证建立的血清型RT-qPCR检测方法;将其应用于库蠓与动物血液样本中BTV的定型。【结果】建立的BTV血清型RT-qPCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,反应的扩增效率(E)值90.3%,相关系数(R2)值在0.991-0.999之间,对12种血清型BTV核酸的检测下限在25-48拷贝之间。对165株BTV的RT-qPCR定型结果与病毒的Seg-2测序鉴定结果一致;对194份采集于哨兵动物的BTV核酸阳性血液样本的RT-qPCR定型结果与感染动物上分离BTV的血清型一致。采用建立的方法,从2019年云南省师宗县与景洪市采集的库蠓与牛血液样本中鉴定出6种血清型的BTV(BTV-1、-2、-4、-5、-16和-24)。【结论】研究建立的12种BTV血清型RT-qPCR定型方法具有特异、敏感和省时的优点,可用于媒介与动物感染BTV的血清型定型,具有良好的应用与推广价值。