狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法的建立

建立狂犬病病毒TaqMan qRT-PCR检测方法,并进行评价和初步应用。针对狂犬病病毒L基因保守区域设计特异性引物、探针,建立PCR反应体系并评价检测体系的扩增效率、灵敏度、特异性和准确性等指标,灵敏度评价结果与现有巢式RT-PCR和基于N基因qRT-PCR检测方法相比较。结果显示本研究建立的基于L基因qRTPCR检测体系扩增效率高于90%;最小检测病毒滴度为2.7×10~(-3)FFU/mL,灵敏度高于基于N基因qRT-PCR和巢式RT-PCR 100倍;最小检测核酸拷贝数为100拷贝,建立了基于目的基因RNA标准品的标准曲线,可用于定量检测;对于我国的狂犬病病毒流行毒株检测范围较广,动物样本检测结果与金标准DFA检测结果相一致,准确性较高。本研究建立的狂犬病病毒qRT-PCR可用于狂犬病病毒实验室检测。     

RFFIT、FAVN、ELISA及狂犬病中和抗体检测试剂盒对狂犬病抗体检测的比较研究

为了比较RFFIT、FAVN、ELISA及狂犬病中和抗体检测试剂盒(RVNA Kit)等四种方法对狂犬病抗体的检测效果,对65份狂犬病疫苗免疫前、免疫后临床血清样本,分别使用RFFIT、FAVN、ELISA及RVNA Kit方法对狂犬病病毒特异性抗体进行测定,并对检测结果的阳性符合率、相关性及重复性进行分析。检测结果显示,RFFIT、FAVN及RVNA kit的阳性符合率为100%,三种方法与ELISA试剂盒的阳性符合率为95.38%,对0.5IU/mL~10IU/mL的血清样本进行阳性符合率分析显示,四种方法的阳性符合率为100%;相关性研究结果表明,RFFIT、FAVN及RVNA Kit之间任意两种方法检测结果的相关系数均超过0.97,但ELISA与其他三种方法检测结果的相关系数均低于0.86;同一份样品的重复性检验结果显示,RVNA Kit和ELISA比RFFIT和FAVN具有更好的重复性,而RVNA Kit的重复性最好,其变异系数仅6%。研究结果表明,RFFIT、FAVN及RVNA Kit等三种方法可通用于血清中抗狂犬病病毒中和抗体的检测,而ELISA检测结果与中和抗体效价有一定差距,但在经过优化、校验后ELISA也可以在有效范围内用于狂犬病抗体的检测。     

风疹病毒多表位诊断抗原的制备与评价

原核表达与层析纯化获取风疹病毒(Rubella Virus,RV)多表位诊断抗原,并初步评价其抗原性。将RV衣壳蛋白C aa 3~29、aa 96~123以及包膜糖蛋白E1aa208~247三个主要免疫显性表位串联,密码子优化后全基因合成;利用基因重组技术将多表位串联片段插入带有GST标签的表达质粒中,在大肠杆菌中进行表达,并利用亲和层析和离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western Blot(WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立RV-IgM抗体检测ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。获取高度均质的RV多表位诊断抗原,WB实验表明目的蛋白不但可以被anti-GST单克隆抗体识别,还可以被anti-RV多克隆抗体、RV-IgM阳性血清相应抗体所识别。分别对48份RV急性感染病例的阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测,发现一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性良好的RV多表位诊断抗原,偶联HRP后可以作为检测抗原应用于RV-IgM ELISA血清学检测中。