改良的大鼠脑组织总RNA抽提方法

目的:建立一种简单方便、结果稳定的抽提大鼠脑组织总RNA的方法。方法:在传统一步法抽提动物组织总RNA的基础上,通过增加抽提步骤使总RNA与细胞DNA、蛋白质、细胞残片等干扰总RNA质量的杂质有效分离。结果:建立了可以快速、稳定地获得高纯度、未被降解的大鼠脑组织总RNA的方法。结论:采用改良的方法抽提到的总RNA比用传统的一步法得到的总RNA的完整性和均一性好,可直接应用于分子生物学操作。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

检测蜜蜂急性麻痹病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立和初步应用

[背景] 蜜蜂急性麻痹病毒（Acute Bee Paralysis Virus,ABPV）是一种高毒力的蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的大批死亡和蜂群衰竭。[目的] 建立一种快速、灵敏的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法。[方法] 根据ABPV衣壳蛋白基因保守序列设计引物和探针,通过对引物、探针浓度和退火温度等反应条件进行优化,建立基于TaqMan探针检测ABPV的实时荧光RT-PCR方法,并对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行验证。[结果] ABPV实时荧光RT-PCR检测方法在9.8×10¹-9.8×10⁸ copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R²为0.998,扩增效率为103.8%。该方法的检测灵敏度为9.8 copies/μL;对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别为0.19%-0.80%和0.57%-1.07%,重复性良好。对2018年-2019年在福建地区采集的70份蜜蜂样品进行ABPV检测,阳性率为2.86%。[结论] 建立的ABPV实时荧光RT-PCR检测方法能用于该病的实验室检测、流行病学调查和疫情监测。     

应用PCR技术快速检测熊蜂短膜虫

【目的】近年来,熊蜂作为温室作物的理想授粉者在国外已被广泛利用,并且获得很好的经济效益和生态效益,所以国外熊蜂经常被进口用于设施农业。熊蜂短膜虫Crithidia bombi是熊蜂的一种重要寄生虫病,一旦随进口熊蜂传入,将给国内熊蜂蜂群带来严重危害,因此迫切需要建立一种熊蜂短膜虫检测方法。【方法】基于熊蜂短膜虫基因内转录间隔区(internal transcribed space,ITS)基因序列设计了一对引物(Cri-F/R),建立了熊蜂短膜虫的PCR检测方法,并对退火温度、引物浓度和循环个数等反应条件进行了优化,同时验证了该PCR方法的灵敏性、特异性和稳定性。【结果】以熊蜂短膜虫ITS基因保守区设计特异性引物建立的熊蜂短膜虫PCR检测方法是可行的。优化的PCR反应条件为:退火温度59℃,引物浓度0.5μmol/L,扩增循环数35次。对感染熊蜂短膜虫的熊蜂总DNA的灵敏度达到13.24×10-5ng/μL,并具有良好的特异性和稳定性。将该方法应用于熊蜂短膜虫的检测,整个检测过程不超过4 h,具有良好的适用性。【结论】研究建立了熊蜂短膜虫检测方法,能用于疫情监测和进境熊蜂的检验检疫。     

进境蜜蜂疫病传入风险分析

为有效防范疫病传入,保护国内生态和环境安全,本文根据新西兰风险分析模型,从传入释放的可能性、定殖和扩散的可能性以及对经济和生态的潜在危害性3个方面对进境蜜蜂所可能携带的病毒、细菌、真菌、寄生物和敌害等危害进行风险分析。结果表明,蜂群崩溃失调病Colony Collapse Disorder、美洲幼虫腐臭病American Foulbrood、欧洲幼虫腐臭病European Foulbrood、武氏蜂盾螨Acrapis woodi、小蜂螨Tropilaelaps spp.、狄斯瓦螨Varroa destructor、蚤蝇Apocephalus borealis和蜂巢小甲虫Small Hive Beetle(Aethina tumida Murray,SHB)等8种病虫害能给国内蜜蜂带来一定的风险,根据风险评估结果,提出了相应的风险管理措施。研究结果能为制定相应的检疫措施提供科学依据。