人3型副流感病毒F蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中表达的研究

目的用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac~? baculovirus expression systems, Bac-to-Bac BES)表达人3型副流感病毒(human parainfluenza virus type 3, HPIV-3)的重组融合蛋白(fusion protein, F),并研究密码子优化、疏水性区域、SUMOStar融合标签及gp67分泌信号肽对目的蛋白表达的影响,同时研究F蛋白的抗原性与免疫原性。方法全基因合成HPIV-3 F蛋白昆虫细胞密码子优化基因序列,设计特异性引物,经PCR扩增获得HPIV-3全长优化型F基因(op-F)、去除N端和C端疏水区域的截短优化型F基因(opt-F)和截短野生型F基因(wtt-F);将以上基因分别构建至pFastBac1、pI-SUMOStar、pI-secSUMOStar 3种载体,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对各目的基因对应的蛋白进行表达。利用SDS-PAGE、Western blot等方法对各目的蛋白的表达及特异性进行检测。用纯化的重组opt-F蛋白免疫青紫蓝兔,制备F蛋白特异性抗体。结果 (1)对HPIV-3的opt-F基因及wtt-F基因的表达对比显示,opt-F基因在3种载体中都得到了良好表达,而wtt-F基因在3种载体中均未表达,说明密码子优化对目的基因的表达具有重要作用;(2)对HPIV-3的op-F基因及opt-F基因在pFastBac1载体中的表达对比显示,opt-F基因得到了良好表达,而op-F基因未表达,说明疏水性区域可显著影响目的基因的表达;(3)对HPIV-3的opt-F基因在pFastBac1及pI-SUMOStar载体中的表达对比显示,SUMOStar融合标签可使opt-F基因的表达量明显提高;(4)对HPIV-3的opt-F基因在pI-SUMOStar及pI-secSUMOStar载体中的表达研究显示,添加gp67分泌信号肽后未检测到opt-F基因的可溶性表达,说明gp67信号肽对目的蛋白无促可溶性表达效果。(5)纯化的opt-F/pI-SUMOStar蛋白免疫青紫蓝兔,得到了滴度为1∶8 192的抗血清。Western blot显示,此血清可以特异性结合HPIV-3病毒的F蛋白。结论密码子优化、N/C端疏水区域的去除以及SUMOStar融合标签的嵌合,可以显著提高F蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达。     

霍乱毒素B亚基融合蛋白表达载体的构建

采用PCR技术将霍乱弧菌CTB基因的终止密码子定点突变并引入一个EcoR Ⅰ位点,然后与人工合成的Linker连接,构建成了新颖的融合蛋白表达载体。在CTB 3′端的Linker上有四个单一人酶切位点,在任何限制性位点融合外源基因序列后,都可在3′端形成转译终止密码子。     

甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

猪肥胖基因在大肠杆菌中的高效融合表达

采用PCR方法扩增猪肥胖基因编码原成熟蛋白cDNA序列,并在5′端加上BamHⅠ位点,3′端加上EoRⅠ位点,将5′端密码子CCC转变为大肠杆菌常见密码子CCG,扩增得到459bp的片段,克隆于融合表达载体p GEX-2TBamHⅠ和EcoRⅠ位点,酶切、测序正确,经0．1mmol/LIPTG诱导表达出一条约42kD的融合蛋白,其中26kD为pGEX-2T中带有的谷胱苷肽转移酶,16kD是猪肥胖基因表达产物瘦蛋白。利用非融合表达产品制备抗血清,检测融合表达的重组蛋白,Western-blot为阳性。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

稀有密码子影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白原核表达

通过限制性内切酶克隆法构建两个pET-28a-TAT-RNaseH-Apaf1重组质粒,其中一个质粒经过稀有密码子的优化。将两个重组质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)和Transetta(DE3),通过SDS-PAGE观察相应融合蛋白诱导表达的情况,并用His标签抗体和Apaf1抗体通过Western Blotting鉴定诱导蛋白。菌液PCR和测序证明经稀有密码子优化和未经稀有密码子优化的人源RNaseH-Apaf1序列成功重组到pET-28a-TAT载体中;经稀有密码子优化的重组质粒成功地在大肠杆菌宿主菌中表达RNaseH-Apaf1融合蛋白,并用Western Blotting检测到该融合蛋白。结果表明,稀有密码子可影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白的原核表达。     

猪圆环病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达研究

研究猪圆病毒衣壳蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况。以3个不同的质粒为基础,构建不同类型的猪圆环病毒衣壳蛋白基因(PCV2-ORF2)重组表达载体,并分别转化进入枯草芽孢杆菌168和WB800中。利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达,并通过实时荧光定量PCR检测目的基因的转录水平上的表达情况。结果显示,ORF2基因原序列在枯草芽孢杆菌中难以表达,经过密码子优化后,构建的截短ORF2基因表达载体在枯草芽孢杆菌内表达系统中成功表达目的蛋白。密码子优化促进了目的基因的表达。     

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的:获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果:肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论:采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。     

三种禽病毒抗原的串联表达、纯化及活性鉴定

为实现多个基因在同一菌株中均一可溶性表达,简化基因工程亚单位多联多价疫苗中抗原生产的工艺步骤,本研究选用Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4) Fiber-2蛋白、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白和减蛋综合征病毒(EDSV)Fiber蛋白3种来自不同禽病毒的抗原为研究对象,利用原核表达系统,通过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序优化,获得单一载体/多重转录单元的共表达重组质粒。将共表达重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,进行3个基因的共表达。纯化后的蛋白进行Western blotting和蛋白活性检测。结果表明,目的基因经过密码子优化、载体启动子改造和基因串联顺序的优化后,获得均一可溶性共表达的3种蛋白,纯化后蛋白纯度大于80%,Western blotting分析和琼脂扩散试验表明串联表达的3种蛋白具有免疫反应性和抗原活性。文中通过目的基因密码子优化、表达载体启动子改造和基因串联等关键技术的突破,首次实现了3种不同禽病毒抗原的高效、均一、可溶性串联表达和纯化,为基因工程亚单位多联多价疫苗的研制奠定了基础。     

Microbial production of spider silk proteins.

The remarkable properties of spider dragline silk and related protein polymers will find many applications if the materials can be produced economically. We have demonstrated the production of high molecular weight spider dragline silk analog proteins encoded by synthetic genes in several microbial systems, including Escherichia coli and Pichia pastoris. In E. coli, proteins of up to 1000 amino acids in length could be produced efficiently, but the yield and homogeneity of higher molecular weight silk proteins were found to be limited by truncated synthesis, probably as a result of ribosome termination errors. No such phenomenon was observed in the yeast P. pastoris, where higher molecular weight silk proteins could be produced without heterogeneity due to truncated synthesis. Spider dragline silk analog proteins could be secreted by P. pastoris when fused to both the signal sequence and N-terminal pro-sequence of the Saccharomyces cerevisiae alpha-mating factor gene.     

外源丙氨酸提高蜘蛛牵引丝蛋白天然基因在原核系统中的表达

蜘蛛丝蛋白天然基因的体外表达受诸多因素的限制。本研究在获得生长于中国的Nephila clavipes蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA（Genbank Accession No. AF441245）的基础上,利用限制性内切酶双酶切反应构建含有Spidroin2 cDNA的重组表达质粒pET-28b(+)-Sp。将该质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）宿主细胞感受态菌中,以不同浓度的IPTG进行诱导,并通过诱导时间、培养温度、加入外源丙氨酸等途径提高Spidroin2 cDNA的表达量,同时利用多克隆抗体对表达产物进行Western blot检测。重组质粒pET-28b(+)-Sp的测序结果表明Spidroin2 cDNA基因以正确的阅读框插入到原核表达载体中;SDS-PAGE结果表明菌体表达蛋白中存在着大小约为31 kDa的目的蛋白带（加入外源丙氨酸条件下）,Western blot检测结果进一步证实,目的基因在大肠杆菌中得到正确表达。本研究证实,蜘蛛牵引丝蛋白Spidroin2 cDNA可在原核细胞内正确表达,外源丙氨酸的加入对于提高天然蜘蛛丝蛋白基因在原核系统的表达作用明显。     

兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体的制备及应用

将仿蜘蛛牵丝基因s6 0 0克隆到GST融合蛋白表达质粒pGEX KG中 ,利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了仿蜘蛛牵丝蛋白S6 0 0 ,以之作为抗原制备了兔抗血清。S6 0 0的氨基酸组分分析与理论值相吻合。蛋白质免疫印迹发现该抗血清能与天然蜘蛛丝反应 ,表明设计的仿蜘蛛丝与天然蜘蛛丝有相似的免疫原性。为了定量检测仿蜘蛛牵丝蛋白在转基因家蚕丝腺中 (或茧壳中 )的表达 ,建立了用ELISA方法定量检测茧壳中仿蜘蛛牵丝蛋白量的工作系统     

大腹园蛛次壶腹腺丝的表达

基于大腹园蛛次壶腹腺丝Minor Ampullate Spidroin全长编码基因最新报道,研究了该基因的表达。利用PCR扩增该基因重复区一段长1 348 bp的片段P1,融合his-tag标签,构建酵母表达载体,在毕赤酵母菌GS115进行表达。同时构建大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,P1在两种表达系统中均可实现表达。研究结果显示:P1在GS115中的表达经优化后产量、产率有较大提高,且远高于BL21(DE3)中的表达,相应的纯化效率GS115也远高于对照BL21(DE3)的表达。研究表明酵母表达系统更适合重复度高、且富含Gly/Ala的天然蛛丝蛋白基因的表达,为表达全长天然MiSp编码序列提供前期实验基础,也为大规模蛛丝蛋白的重组表达建立了平台。     

Conquering isoleucine auxotrophy of Escherichia coli BLR(DE3) to recombinantly produce spider silk proteins in minimal media

Large-scale production of recombinant spider silk proteins is a long-term goal for their industrial use. Therefore, we have recently developed a process for bacterial production. Due to a highly repetitive gene sequence of spider silks, the host strain E. coli BLR(DE3) was employed since it shows no homologue recombination. Although perfectly suited for production in full media, the BLR strain does not grow in cost-effective minimal media, indicating a previously not reported L: -isoleucine auxotrophy. We provide evidence that mutated threonine deaminase is likely responsible for the detected auxotrophy of BLR.     

蜘蛛拖丝蛋白基因的构建及在大肠杆菌中的表达

蜘蛛大壶腹线产生的拖丝是非常优良的纤维蛋白, 具有独特的强度和弹性。基于拖丝蛋白高度重复序列和部分cDNA序列, 合成蜘蛛拖丝蛋白基因单体, 通过头尾相连的构建策略, 得到拖丝蛋白多聚体, 与原核高效表达载体pET30a(+)连接, 转化大肠杆菌BLR(DE3), 用IPTG诱导表达。 表达产物经His.Bind树脂金属螯合亲和层析一步纯化, 纯度达90%以上, 表达量为20mg/L。SDS-PAGE和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为37kD, 其值与氨基酸组分分析结果与理论推算值基本符合。      

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21（DE3）细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。     

利用生物工程技术生产蜘蛛丝的研究进展

蜘蛛丝是一种高分子蛋白纤维,具有高强度、高弹性等许多重要的优良特性,在军事、医学、工业、建筑、纺织等领域具有广泛而巨大的应用。然而蜘蛛的产丝量小,且无法高密度养殖以获取大量的蜘蛛丝,难以满足实际应用的需要。于是人们只能着眼于生物工程方法,即将蜘蛛丝蛋白基因转入其它生物体来表达生产蜘蛛丝蛋白,经过多年的研究,已取得很多重要的进展。对蜘蛛丝蛋白在微生物、植物、哺乳动物及家蚕等不同生物载体中表达的研究进展进行重点阐述,并探讨了已有研究的不足和今后研究展望,为进一步探索和研发蜘蛛丝的规模化生产方法提供借鉴与参考。     

The embryonic origin of the ampullate silk glands of the spider Cupiennius salei

Silk production in spiders is considered a key innovation, and to have been vital for the diversification of the clade. The evolutionary origin of the organs involved in spider silk production, however, and in particular of the silk glands, is poorly understood. Homologies have been proposed between these and other glands found in arachnids, but lacking knowledge of the embryonic development of spider silk glands hampers an evaluation of hypotheses. This study focuses on the embryonic origin of the largest silk glands of the spider Cupiennius salei, the major and minor ampullate glands. We show how the ampullate glands originate from ectodermal invaginations on the embryonic spinneret limb buds, in relation to morphogenesis of these buds. Moreover, we visualize the subsequent growth of the ampullate glands in sections of the early postembryonic stages. The invaginations are shown to correlate with expression of the proneural gene CsASH2, which is remarkable since it has been proposed that spider silk glands and their nozzles originate from sensory bristles. Hence, by confirming the ectodermal origin of spider silk glands, and by describing the (post-)embryonic morphogenesis of the ampullate glands, this work provides a starting point for further investigating into the genetic program that underlies their development.