结核分枝杆菌4种抗原的基因克隆、表达、纯化和抗原性初步检测

目的:克隆38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等4种结核分枝杆菌抗原基因,利用大肠杆菌表达系统分别表达重组蛋白,纯化并初步评价其抗原性。方法:通过PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64抗原的基因,连接入pBVIL1表达载体,在大肠杆菌HB101株中进行表达,以间接ELISA方法初步评价其抗原性。结果:获得了结核分枝杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,初步验证所纯化获得的抗原具有良好的抗原性。结论:pBVIL1表达载体可以高效表达多种结核分枝杆菌抗原,38kD、ESAT-6和CFP10抗原均可作为结核病血清学诊断的候选抗原。     

SARS冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及活性测定

利用PCR基因扩增法,以SARS冠状病毒全基因质粒为模板,获得N蛋白相应抗原基因,构建了表达载体pBV220／SARS-N,并在E．coli中获得高效表达。用纯化后的N蛋白抗原包被测定板,通过间接ELISA法对阴阳性血清进行活性测定,结果表明,在46份阳性血中有41份被测出,检出率为89．13％。本研究克隆并表达了SARS冠状病毒N蛋白,为进一步研制SARS病人抗体检测试剂和SARS疫苗奠定了基础。     

抗丙型肝炎病毒NS3蛋白不同型单抗制备及应用

目的：制备抗丙型肝炎病毒NS3Ⅰ、Ⅱ型单克隆抗体,用于转HCV全长基因细胞免疫组化定位。方法:克隆表达HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ型抗原,免疫Balb／C小鼠,通过细胞融合筛选分泌HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ的细胞株,制备腹水,纯化IgG。结果：制备出3株抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单克隆抗体,有2株为IgG-1型,1株为IgG-2b型,对转HCV全长基因细胞进行免疫组化染色,胞浆为阳性。结论：制备的抗HCV-NS3Ⅰ、Ⅱ单抗具有良好的特异性。     

丙型肝炎病毒感染的体外培养细胞的抗原表达

建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染细胞模型,观察其感染细胞的HCV抗原表达,用抗HCV抗体和HCVRNA阳性及阴性血清感染MOLT-4细胞,制备细胞片进行免疫酶染色。结果显示HCV感染MOLT-4细胞4天和阴性对照HCV抗原均为阴性;感染后7天胞浆内可见HCV抗原阳性免疫反应产物;15天阳性细胞达到高峰,43天仍可见少量阳性细胞。结果表明HCV体外感染MOLT-4细胞胞浆内观察到HCV抗原表达。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型核心蛋白(p24)在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95％以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。     

甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶在酵母系统中的可溶性表达

利用毕赤酵母系统表达具有催化活性的丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白酶 .将PCR直接扩增的病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因和重组的带有辅酶的单链NS3 NS4A蛋白酶基因 ,分别插入表达载体pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ克隆位点 ,转化毕赤酵母GS115 ,可溶性表达NS3蛋白酶和单链NS3 4A蛋白酶 ;ELISA法测定表达蛋白酶的抗原性 ;原核高效表达载体pBVIL1表达酶切底物NS5A B片段 ,体外与蛋白酶共同温育 ,SDS PAGE鉴定蛋白酶催化活性 .载体测序结果表明 ,重组载体pPICZαA NS3和pPICZαA NS3 4A中的目的基因序列插入正确 ;SDS PAGE结果显示 ,培养物上清中存在分泌型目的蛋白带 ;ELISA结果证实 ,表达蛋白与HCV阳性血清有结合活性 ;蛋白酶与底物NS5A B片段不同作用时间的SDS PAGE ,看到约 2 4kD处底物条带的分解 .说明用毕赤酵母表达系统成功地表达了可溶性HCVNS3和单链NS3 4A蛋白酶 ;两种结构形式的蛋白酶在体外系统中都有催化活性 ,同时也都具有抗原性 .该研究为大量和方便地获得有催化活性的HCVNS3蛋白酶提供了有效途径 .     

结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片的制备

目的：利用克隆表达的7种结核分枝杆菌优势表位抗原,建立可视化抗体检测蛋白芯片,用于结核病辅助诊断。方法：将7种结核分枝杆菌优势表位抗原,即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3点于修饰的基片上,制备可检测7种结核抗体的多靶点蛋白微阵列,建立免疫金银染色检测系统;使用该芯片对48例临床结核病患者血液样品进行检测,并与“金标准”痰涂片（48例）和痰培养（其中的29例）检测结果进行比较,分析其敏感性;对30名献血员血液样品进行检测,分析其特异性。结果：可视化抗体检测蛋白芯片的敏感性分别为98.5％和96.6％,而痰涂片和痰培养检测方法的敏感性分别为35.4％和48.3％;可视化抗体检测蛋白芯片的特异性为93.3％。结论：建立的结核分枝杆菌可视化抗体检测蛋白芯片检测敏感性显著高于痰涂片和痰培养方法,可用于结核病的临床辅助诊断,提高痰涂片和痰培养假阴性的检出率。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物基因转录的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对胞外基质金属蛋白酶诱导物（EMMPRIN）基因转录的影响。方法：构建HCV核心蛋白真核表达载体和EMMPRIN启动子删除突变体pGL3载体,应用双萤光素酶报告基因系统检测EMMPRIN启动子不同删除突变体的转录活性,并寻找核心蛋白上调EMMPRIN转录相关的关键启动子区段。结果：HCV核心蛋白可以显著上调EMMPRIN的表达;调节EMMPRIN转录的启动子关键区段为＋1～435bp,HCV核心蛋白主要通过该关键区段上调EMMPRIN的转录,并呈现剂量依赖性。结论：HCV核心蛋白有可能通过EMMPRIN启动子关键区段上调EMMPRIN的转录,从而上调基质金属蛋白酶,最终导致肝癌转移。     

密码子优化的肺炎支原体P1蛋白在大肠杆菌中的克隆表达

目的:获得密码子优化的肺炎支原体P1黏附蛋白优势表位抗原基因,并在大肠杆菌中表达,为临床诊断试剂和疫苗研制打下基础。方法:采用生物信息学分析肺炎支原体P1蛋白的抗原表位,筛选特异性P1蛋白优势表位区;采用大肠杆菌优势密码子,设计上述P1蛋白优势表位基因序列;采用退火PCR技术合成上述基因,并利用载体pGEX-4T-2实现P1优势表位抗原在大肠杆菌中的表达;采用ELISA法对纯化的P1抗原活性进行测定。结果:肺炎支原体P1蛋白特异性抗原表位主要位于1154~1521 aa,获得的P1优化密码子基因平行突变37个稀有密码子和2个终止密码子;在大肠杆菌中表达的GST-P1融合蛋白的相对分子质量为65.9×103,纯化后重组抗原能与肺炎支原体感染者血清发生特异性的免疫反应。结论:采用密码子优化基因合成技术实现了肺炎支原体P1优势表位抗原在大肠杆菌中的高效表达,为肺炎支原体感染的诊断试剂研究提供了重要参考。