利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。     

家蚕核型多角体病毒BmNPV囊膜蛋白P74膜外区克隆和原核表达

通过PCR扩增家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)囊膜蛋白p74基因膜外区片段,对切胶纯化得到的DNA目的片段与原核表达载体pET28a进行连接,通过不同浓度的IPTG对含有pET28a-p74重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳.结果表明p74基因膜外区获得了表达;通过His单抗对原核表达产物进行Western blotting分析,其结果证实诱导蛋白带为融合有组氧酸的目的蛋白.对割胶获得的P74蛋白和免疫佐剂进行克分研磨,以研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,通过收获的抗血清对BmNPV ODV病毒粒子进行Westem blotting分析,检测到一条分子量大小为74 kD的特异杂交带,表明获得的多抗可用于P74蛋白功能的进一步研究.     

不同海拔高原鼠兔个性特征与SERT基因多态性关联

个性特征是指动物个体间稳定、可遗传的行为差异,与相关基因多态性有关,反映了动物对环境的适应模式,探究个性相关基因变异,将有助于更好地理解动物对环境的适应与进化机制。本文以高原鼠兔 (Ochotona curzoniae) 为对象,研究了5个不同海拔地区高原鼠兔的个性 (探究性、勇敢性和温顺性) 差异特征,并检测了个性相关基因5-羟色胺转运体 (SERT) 的单核苷酸多态性 (SNP) 和mRNA表达。结果发现,高海拔地区高原鼠兔的探究性和勇敢性显著高于低海拔地区,而高海拔地区高原鼠兔SERT基因mRNA表达量显著低于低海拔地区,提示不同海拔高原鼠兔个性特征差异可能与SERT基因mRNA表达有所关联。进一步检测不同海拔地区高原鼠兔SERT基因多态性及其分布差异情况,发现该基因存在6个SNP (其中5个位于外显子3,1个位于外显子5 );不同海拔地区鼠兔基因分布差异分析显示外显子5的c.A1063C 同义突变与海拔之间存在显著相关,高海拔地区该位点CC基因型分布频率显著高于低海拔地区;c.A1063C的基因型虽然与探究性、勇敢性无显著相关,但与温顺性显著相关。综上所述,随着海拔升高,高原鼠兔探究性和勇敢性增加,这有利于动物获取更多的食物资源,进而增加其生存机会。与此同时,SERT基因多态性显示与不同海拔地区的生存环境相适应的特征,且与温顺性有关,暗示不同海拔高原鼠兔个性差异可能与SERT基因SNP的差异有关。本研究从基因表达与突变的角度尝试阐述高原鼠兔适应不同海拔环境的行为差异,显示了不同海拔地区高原鼠兔行为生存策略潜在的分子机制。     

家蚕细小病毒样病毒（BmPLV-Z） VD1 ORF4的原核表达

对家蚕细小病毒样病毒（BmPLV-Z）VD1 ORF4理论上编码的氨基酸序列进行Blast搜索,结果表明其与DNA聚合酶B家族同源。通过PCR扩增其DNA聚合酶同源区（1 077 bp）,将扩增的目的DNA片段与原核表达载体pET30a进行连接,通过不同浓度的IPTG对捕获pET30a-1 077 bp重组质粒的大肠埃希菌进行诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE电泳,结果表明其聚合酶同源区获得了表达;Western blot分析进一步确证诱导蛋白为带有6个组氨酸的融合蛋白。将割胶获得的目的蛋白免疫昆明小鼠制备其多抗,以纯化后的抗血清对VD1 ORF4全长序列和部分序列在原核中的漏扫描表达情况进行研究,SDS-PAGE和Western blot结果表明VD1 ORF4全长序列和部分序列的原核表达产物均一,都只有一条特异的目的蛋白带,说明了VD1 ORF4序列在原核表达系统中没有漏扫描表达的蛋白。     

家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的原核表达

通过Primer Premier 5.0设计1对特异性引物,用于扩增家蚕核型多角体病毒囊膜蛋白GP64的部分DNA片段,对PCR扩增得到的DNA片段进行纯化,并对纯化后的双酶切DNA片段与经同样双酶切后的原核表达载体pET28a进行连接;对捕获有重组质粒pET28a-GP64的大肠埃希菌BL21（DE3）细胞进行IPTG诱导,通过SDS-PAGE对诱导产物进行电泳分析,结果表明扩增的目的片段获得了表达;通过His单抗对诱导产物进行Western Blot印迹分析,其结果表明诱导蛋白带为融合有组氨酸的目的蛋白。对原核表达的GP64截短蛋白和免疫佐剂进行充分研磨,将充分研磨后的匀浆液对昆明小鼠进行皮下多点注射,以制备的GP64多抗对家蚕核型多角体病毒粒子感染的BmN细胞总蛋白进行Western Blot印迹分析,结果在杂交膜上出现一条特异杂交带、其分子量大小约为64 ku,表明制备的GP64多抗可用于其功能的进一步研究。     

抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析

制备抗麻痹性贝毒GTX2,3单克隆抗体。利用醛化法将GTX2,3与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原。免疫小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。GTX2,3与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联作为检测抗原,用间接ELISA法筛选阳性克隆株。将筛选的阳性细胞株制备腹水。获得三株稳定分泌抗GTX2,3单克隆抗体的杂交瘤细胞株F4、F10、G9。间接ELISA法检测F10细胞株腹水抗体效价为1.4×10^-5。半抗原GTX2,3与载体蛋白偶联后,作为免疫原,可制备高滴度的抗GTX2,3抗血清和单克隆抗体。该抗体对于藻毒素具有高特异性和高亲和力,可用于污染海产品的麻痹性贝毒的检测。     

在枯草杆菌芽胞表面展示P74蛋白膜外肽段

目的:对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)囊膜蛋白P74膜外肽段与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)CotC与进行融合表达,制备表面展示有P74蛋白的重组芽孢,为深入研究该重组芽孢的功能提供基础.方法:将CotC基因与BmNPV P74膜外编码序列进行融合,构建表达CotC-P74融合蛋白的重组质粒pJS700-p74.通过双交换使该重组质粒中的CotC-P74表达盒整合到枯草芽胞杆菌染色体淀粉酶基因位点,并对发生同源重组后的菌株进行筛选和PCR鉴定.结果:PCR结果表明CotC-P74成功地整合到枯草芽孢杆菌基因组上,通过作者实验室制备的P74多抗对诱导后的重组芽孢衣壳总蛋白进行Western blot分析,结果在49 kDa位置处能杂交到一条特异的蛋白带.结论:P74蛋白胞外肽段成功地展示在枯草芽胞杆菌芽胞表面.     

人巨细胞病毒编码miRNA功能及其作用机制

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）是疱疹病毒β亚科中的代表成员之一,是一种具有囊膜包裹的DNA双链病毒,对免疫耐受群体和先天性感染的婴幼儿具有很高的发病率。HCMV具有潜伏感染和裂解感染两种感染状态。这两种感染过程中均有不同的miRNA表达模式。这些miRNA不仅参与胞内宿主或病毒自身基因表达调控与病毒复制,也能调节胞内物质的转运和病毒感染状态的转变等过程。本文就HCMV编码的miRNA,其生物合成机制和生物学功能进行简要综述,为深入研究其生物功能和作用机制奠定基础。     

细胞自噬在个体发育和肿瘤发生中的作用

细胞自噬是一种广泛存在于真核生物细胞中的代谢过程,参与调控胞内物质合成、降解和重新利用之间的代谢平衡。自噬体与溶酶体的有效融合能有效地保障胞内多余物质的降解及其再利用,是真核细胞所特有的一种自我保护机制。细胞自噬近年来受到广泛的关注,其不仅能充当胞内一个合格的质检员,有效地降解胞内受损的蛋白质成分和细胞器,进而阻止细胞损伤和凋亡,也与肿瘤发生、衰老、神经退行性疾病、人体自身免疫性疾病、肥胖症和糖尿病等多种疾病的发生及发展密切相关。本文旨在对细胞自噬过程和其调控机制进行介绍,并侧重对自噬在生长发育和肿瘤发生中的作用进行综述,为预防与治疗多种人类重大疾病提供理论依据。