甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

真核表达纯化的SARS-CoV-2 N蛋白在不同人群血清检测中的应用性能分析

通过真核系统表达纯化新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的全长核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,N蛋白）,分析其抗原性与应用性能。将SARS-CoV-2 N蛋白表达质粒转染HEK-293T细胞后,通过Western Blot和免疫荧光验证蛋白表达以及表达定位。对N蛋白进行纯化后,通过Western Blot和ELISA并采用多种血清样本（WHO参比品血清、正常人血清、新冠灭活疫苗接种后血清、新冠感染者恢复期血清）对该N蛋白在血清抗体检测中的应用性能进行分析。比较真核系统与原核系统表达的N蛋白抗原性上的差异,并分析基于真核系统表达N蛋白构建的IgG抗体ELISA检测体系与获批的商品化新冠RBD (Receptor binding domain)IgG抗体ELISA检测试剂盒及用于检测中和抗体的活病毒微量中和试验结果间的相关性。结果显示,真核系统表达的全长N蛋白主要定位于胞质,作为抗原检测新冠IgG抗体,具有比原核系统表达的N蛋白更高的检测灵敏度。针对新冠感染者恢复期血清,基于哺乳动物细胞表达的N蛋白构建的ELISA体系检测的IgG抗体滴度与试剂盒检测的RBD-IgG抗...     

广谱流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病,依据病原不同可分为甲、乙、丙三型.乙型和丙型流感病毒均只有一个型,变异相对较少,从未引起世界大流行,而甲型流感病毒亚型多,变异大,曾引起4次世界大流行[1],已成为流感防控和疫苗研究的重点.预防流感大流行最有效的措施是疫苗接种.     

HIV gag基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的:了解gag基因修饰前后在不同载体系统中的表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Gag靶抗原奠定实验基础。方法:将含有优化前后gag基因的HIV-1 DNA(pVRC)疫苗和重组痘苗病毒(rVV)载体疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN-γ酶联免疫斑点法和胞内细胞因子染色检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Gag诱发的免疫效果。结果:DNA疫苗中gag基因修饰后细胞免疫反应由472提高至925 SFC/106MNC,抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由104.2提高至105.3,三针后则没有差别;而以rVV为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应(~320 SFC/106MNC)和抗体水平(~104.4)均没有差异。2种疫苗联合免疫均可显著提高Gag修饰前后在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由1700提高至2100 SFC/106MNC,抗体水平则没有差别。结论:gag基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对rVV疫苗单独免疫效果无明显影响。     

3种市售免疫调节剂作为流感病毒融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的研究

目的:观察具有免疫调节作用的市售左旋咪唑、西米替丁、伐地那非作为甲型流感病毒核蛋白(NP)与基质蛋白2胞外区多肽(M2e)融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的可能性。方法:将左旋咪唑、西米替丁、伐地那非单独或者分别与Al(OH)3配伍作为NM2e蛋白佐剂,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过体液和细胞免疫检测及病毒攻击实验研究这些免疫调节剂作为疫苗佐剂的可能性。结果:左旋咪唑对NM2e蛋白亚单位疫苗无明显的佐剂效应,但与铝佐剂合用可使攻毒后存活小鼠体重恢复加快;西米替丁可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(30%),但保护效果明显低于铝佐剂(70%),与铝佐剂无明显的协同作用;伐地那非能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG1、IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(36%),但与铝佐剂合用有相互抑制作用。结论:左旋咪唑、西米替丁、伐地那非对NM2e蛋白均有一定的免疫调节作用,其中西米替丁和伐地那非能提高攻毒保护效果,但保护效果明显低于Al(OH)3,与Al(OH)3联合使用均无协同作用。     

连花清瘟颗粒等8种中药体外抗新型冠状病毒活性以及细胞毒性研究

为了评估连花清瘟颗粒等中药（Traditional Chinese Medicines,TCMs）体外的抗新型冠状病毒作用。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测药物对Vero细胞的毒性,确定药物的细胞毒性。再以Vero细胞为模型,设置药物组、瑞德西韦对照组、病毒对照组,用新型冠状病毒感染细胞,药物作用48 h,提取核酸,用荧光定量PCR法检测新型冠状病毒RNA拷贝数,评估药物的抗病毒作用。细胞活性结果和病毒RNA拷贝数变化的结果显示,连花清瘟等8种药物中,连花清瘟抗新型冠状病毒活性较好,半数抑制浓度达到了0.43 mg/mL,药物六神丸和藿香正气水的细胞毒性较大,其他5种药物的抗新型冠状病毒活性较低。本研究揭示了莲花清瘟等8种药物体外的抗新型冠状病毒效果,为进一步的研究奠定了基础。     

甲型流感病毒X31(H3N2)小鼠适应后毒力增强与HA及PB2突变相关

流感小鼠适应毒株及感染模型是研究流感病毒致病机理、评价抗流感病毒药物和疫苗效果的重要工具。为建立甲型流感病毒X31(H3N2)的鼠肺适应毒株,并探讨其在小鼠适应过程中毒力增强的分子机制,本研究将X31在BALB/c小鼠肺组织中连续传代,通过观察病毒滴度测定、感染小鼠症状变化、体重改变和致死力等指标,发现X31经过鼠肺连续传代10次以后,病毒毒力逐渐增强,与原代病毒相比,鼠肺中病毒滴度提高10倍,半数致死量(50%lethal dose,LD_(50))提高大于1 000倍。确定获得高致病力的鼠肺适应毒株(Mouse adapted X31,X31_(MA));对X31_(MA)毒株全基因组测序发现,血凝素(Hemagglutinin,HA)基因出现3个有义突变(P221H、V309I、K411T),聚合酶碱性蛋白2(Basic protein 2,PB2)基因出现1个有义突变(M483T)。结果表明,通过在小鼠肺组织中连续传代X31(H3N2)致病力增强,其HA和PB2蛋白中四个适应性突变位点可能与流感病毒X31_(MA)毒力增加相关。本研究为流感疫苗评价及致病机制研究提供了重要技术支持。     

甲型流感病毒核壳蛋白在BALB／c小鼠中酶联免疫斑点法表位的筛选及其与CTL表位的相关性研究

目的：利用甲型流感病毒A／Johannesburg／33／94（H3N2）核壳蛋白（NP）全长肽库筛选BAI卫／c（H-2^d）小鼠中NP酶联免疫斑点法（EUSPOT）表位,研究其和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位的一致性关系,为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供实验依据。方法：以甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）（PR8）感染BALB／c（H-2^d）小鼠后,通过检测T细胞分泌γ-干扰素（IFN-1）的ELISPOT法和体内CTL法检测NP所诱发的细胞免疫反应,综合分析ELlSPOT和CTL表位肽之间的关系。结果：Pep36（NP第141-155位氨基酸残基,SNLNDTTYQRTRALV）和Pep37（NP第145-159位氨基酸残基,DTTYQRTRALVRTGM）可以诱发较强的ELlSPOT反应,根据Pep36和Pep37共有序列合成的Pep147-155（NP第147-155位氨基酸残基,TYQRTRALV）可以诱发与这2条多肽相同强度的ELlSPOT反应,表明Pep147-155为NP诱发ELlSPOT反应的最强表位,体内CTL也表明它是最强的CTL表位;Pep95（NP第377-391位氨基酸残基,STLELRSRYWAIRTR）、Pep96（NP第381-395位氨基酸残基,LRSRYWAIRTRSGGN）和其他表位肽诱发的ELISPOT反应较弱,体内CTL反应也较弱。结论：BALB／c（H-2^d）小鼠中,甲型流感病毒NP诱发ELlSPOT反应和CTL反应的表位肽高度相关;实验结果为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供了实验依据。     

溯本追源,关口布局,加强人兽共患传染病基础科学研究:“重大突发动物源性人兽共患病跨种感染与传播机制研究”项目获得国家重点研发计划资助

以中东呼吸综合征冠状病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等为代表的人畜共患病病毒对全球公共卫生健康产生了巨大的威胁。由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所牵头、谭文杰研究员作为项目首席科学家的"重大突发动物源性人兽共患病跨种感染与传播机制研究"项目获得"十三五"国家重点研发计划"畜禽重大疫病防控与高效安全养殖综合技术研发"专项资助,将为从源头、传播、感染靶点三个层次有效阻断动物源性人兽共患病发生及疫病防控提供科学依据与技术支撑。