甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化

为了在大肠杆菌中高效表达甲型流感病毒A/京科/30/95(H3N2)核蛋白NP,以便对原核表达的NP蛋白进行免疫原性研究,本研究通过密码子优化及全基因合成等方法,将3种形式的NP基因:与6×His标签融合的NP基因NP(His)、非融合的野生型NP基因NPwt及非融合的按大肠杆菌优势密码子改造的基因NP(O)分别插入原核表达载体pET-30a,构建了表达3种形式NP基因的3种原核表达质粒并研究不同质粒中NP蛋白的表达形式、条件、纯化工艺及抗原性。限制性酶切反应与测序表明,三种形式的NP基因均正确插入原核表达质粒pET-30a;SDS-PAGE凝胶电泳显示,三种形式的NP基因均能在大肠杆菌中表达,NP(O)基因的表达量最高;在不同温度诱导条件下,NP蛋白呈现可溶性表达,NP(O)基因可溶性高效表达的条件为:T=25℃,t=10 h;经阴离子交换和凝胶过滤层析两步纯化,可溶性表达的NP蛋白纯度可达90%;Western blot检测显示,纯化的NP能与流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株感染小鼠的血清发生特异性结合。这些结果表明,非融合表达的密码子优化甲型流感病毒NP蛋白能在大肠杆菌中高效表达和纯化,同时保持良好的免疫反应活性。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

猕猴桃属美味猕猴桃和毛花猕猴桃种间杂交的胚胎学和胚援救

本文报道美味猕猴桃(Actintdia delictosa cv.Hayward)(6x)和毛花猕猴桃(A.eria-ntha)(2x)杂交当代种子的胚胎学分析和胚援救的结果:1.根据杂交种子外部形态和胚胎发育程度,区分为正常的和败育的两类,其比率接近1:1。正常种子的胚发育分化正常,且含有适量胚乳。败育种子中,除少数不含胚和胚乳外,绝大多数种子的胚发育终止于球形、心形和早子叶阶段,胚体畸形。胚乳处于消失或完全解体。2.在被试8组培养基中,最适合胚萌发和生长的是:MS+IAA0.5ppm+GA_30.5ppm,MS+2ip2ppm+IAA0.5ppm+GA_30.5ppm和 MS+2ip2ppm+GA_30.5ppm。适于实生苗生长的培养基为 MS+GA_30.5ppm 和 MS 培养基。在 MS+BAP2ppm 和 MS+IAA0.5ppm+GA_30.5ppm 培养基上,一些正常种子和少数不正常种子胚的下胚轴直接形成了许多不定芽,从而诱导产生了更多的杂种植株。但是在MS十BAP2ppm+GA_30.5ppm,MS+BAP2ppm+IAA0.5ppm 和 MS+2ip2ppm+GA_30.5ppm培养基上,虽然胚产生了愈伤组织,但都未分化出器官。杂种实生苗根尖细胞近半数的含有近4倍性染色体数(4x=116),约半数为其他倍性。     

非复制重组痘苗病毒表达人免疫缺陷病毒Bostwana C亚型Nef蛋白及免疫效果的观察

从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C 8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.     

人免疫缺陷病毒早期蛋白Nef的表达、纯化及免疫原性研究

目的：通过原核细胞表达人免疫缺陷病毒（HIV）Nef抗原,制备特异抗血清,为Nef抗原检测提供技术方法。方法：以HIVBotswana毒株基因组为模板,用PCR法获得Nef蛋白编码基因,将其克隆到pET30a载体中,在大肠杆菌中表达Nef融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清,用真核表达的Nef抗原对其特异性进行分析。结果：构建的Nef融合基因在大肠杆菌中获得表达,相对分子质量约为36x103,免疫BALB／c小鼠获得针对融合蛋白的高效价抗血清,ELISA抗体滴度为1：6400;免疫荧光和Westemblot检测表明,该抗血清能特异地与重组痘苗病毒表达的Nef抗原反应。结论：在大肠杆菌中表达了HIVNef融合蛋白,制备了Nef融合蛋白的高效价小鼠免疫血清,该血清能特异性识别HIVNef抗原,为HlVNef抗原检测提供了技术方法。     

广谱流感疫苗研究进展

流感是由流感病毒引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病,依据病原不同可分为甲、乙、丙三型.乙型和丙型流感病毒均只有一个型,变异相对较少,从未引起世界大流行,而甲型流感病毒亚型多,变异大,曾引起4次世界大流行[1],已成为流感防控和疫苗研究的重点.预防流感大流行最有效的措施是疫苗接种.     

HIV gag基因修饰在不同载体系统中对免疫效果的影响

目的:了解gag基因修饰前后在不同载体系统中的表达水平差异对免疫效果的影响,为确定HIV疫苗中能诱发较高水平细胞免疫的Gag靶抗原奠定实验基础。方法:将含有优化前后gag基因的HIV-1 DNA(pVRC)疫苗和重组痘苗病毒(rVV)载体疫苗单独或联合免疫BALB/c小鼠,利用IFN-γ酶联免疫斑点法和胞内细胞因子染色检测各组的细胞免疫效果,ELISA检测体液免疫水平,分别比较基因优化前后及在不同载体内的Gag诱发的免疫效果。结果:DNA疫苗中gag基因修饰后细胞免疫反应由472提高至925 SFC/106MNC,抗体滴度随免疫次数增加而提高,基因修饰后第二针的抗体水平由104.2提高至105.3,三针后则没有差别;而以rVV为载体的疫苗基因修饰前后细胞免疫反应(~320 SFC/106MNC)和抗体水平(~104.4)均没有差异。2种疫苗联合免疫均可显著提高Gag修饰前后在小鼠体内的免疫效果,基因修饰后细胞免疫反应由1700提高至2100 SFC/106MNC,抗体水平则没有差别。结论:gag基因修饰明显提高常规DNA疫苗免疫效果,并可进一步提高联合免疫效果,但对rVV疫苗单独免疫效果无明显影响。     

不同佐剂对含S+PreS1融合抗原的乙型肝炎病毒颗粒疫苗免疫原性的影响

本研究在前期工作基础上,用CHO细胞表达的含PreS1+S融合抗原的新型基因工程HBV颗粒疫苗(HBSS1)与Al(OH)3、CpG及CpG+Al(OH)3等佐剂配伍,在Balb/C小鼠模型上研究不同佐剂对HBV颗粒疫苗肌肉注射后免疫应答的影响,主要包括抗体滴度、抗体亚型分类及特异性细胞免疫(γ-IFNELISpot检测)。结果表明:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗可快速诱导(单针免疫)高水平的抗PreS1及S抗体,IgG2a/IgG1比率1,同时可诱导较高抗原特异的细胞免疫应答;Al(OH)3+CpG双佐剂组一次免疫后可诱导产生最高的抗S抗体滴度(1:105),其产生的抗体亚类包括IgG1、IgG2a与IgG2b;在S抗原N端(13~49aa)存在优势CTL表位。结论:CpG佐剂结合HBSS1颗粒疫苗应是发展新型治疗性乙肝疫苗的较佳选项。     

3种市售免疫调节剂作为流感病毒融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的研究

目的:观察具有免疫调节作用的市售左旋咪唑、西米替丁、伐地那非作为甲型流感病毒核蛋白(NP)与基质蛋白2胞外区多肽(M2e)融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的可能性。方法:将左旋咪唑、西米替丁、伐地那非单独或者分别与Al(OH)3配伍作为NM2e蛋白佐剂,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过体液和细胞免疫检测及病毒攻击实验研究这些免疫调节剂作为疫苗佐剂的可能性。结果:左旋咪唑对NM2e蛋白亚单位疫苗无明显的佐剂效应,但与铝佐剂合用可使攻毒后存活小鼠体重恢复加快;西米替丁可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(30%),但保护效果明显低于铝佐剂(70%),与铝佐剂无明显的协同作用;伐地那非能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG1、IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(36%),但与铝佐剂合用有相互抑制作用。结论:左旋咪唑、西米替丁、伐地那非对NM2e蛋白均有一定的免疫调节作用,其中西米替丁和伐地那非能提高攻毒保护效果,但保护效果明显低于Al(OH)3,与Al(OH)3联合使用均无协同作用。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。