产3-羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究

将连接编码甘油脱水酶的基因重组质粒pEtac-dhaB和连接编码乙醛脱氢酶编码基因aldh的重组质粒pUCtac共转化大肠杆菌,得到产3-羟基丙酸重组大肠杆菌JM109(pUCtac-aldh,pEtac-dhaB),并对影响该重组菌发酵的营养因子进行研究.试验结果表明:该重组菌转化甘油合成3-羟基丙酸的适宜培养基组成为甘油40 g/L、酵母膏6 g/L、维生素B12 0.02 g/L以及KH2PO4 7.5 g/L; 3-羟基丙酸产量和转化率分别达到4.92 g/L和12.3 %.     

腺苷钴胺素合成酶基因cobs的克隆及其在产1,3-丙二醇菌中的应用

甘油脱水酶是催化由甘油到1,3-丙二醇过程中的关键酶,它需要在辅酶B_(12)存在的情况下才能有效的进行催化;而在此催化过程中甘油脱水酶会出现失活现象,研究表明辅酶B_(12)可以有效的促使甘油脱水酶复活。因此,辅酶B_(12)在由甘油生物催化生产1,3-丙二醇过程中起到非常重要的作用。本研究利用PCR扩增技术,从Escherichia K-12菌株中扩增出产VB_(12)关键酶—腺苷钴胺素合成酶基因cobs,其序列与NCBI上已经公布的序列比对,同源性为99.6%,将基因cobs与产1,3-丙二醇关键酶基因dhaB、yqhD在Klebsiella pneumoniae中共表达,发酵结果显示重组菌所需额外添加的VB_(12)由原始菌株的0.01 g/L下降到0.004 g/L。     

含甘油脱水酶激活因子编码基因的产1,3-丙二醇新型重组菌的构建

利用PCR技术扩增来源于弗氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)的甘油脱水酶编码基因dhaB以及甘油脱水酶激活因子编码基因dhaGdhaF,将其与1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD串联在温控表达载体pHsh上,构建重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量同核酸序列测定的推导值相符。与未串联甘油脱水酶激活因子编码基因的重组菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)相比,1,3-丙二醇的产量提高了28%。     

淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。     

利用PDOR同工酶基因yqhD对产1,3-丙二醇克雷伯氏杆菌进行基因工程改造

由于Klebsiella pneumoniae 1,3-丙二醇合成途径中,加强甘油脱水酶基因表达,导致因NADH供应不足使3-羟基丙醛累积,并对菌体生长及1,3-丙二醇合成造成负面影响。为改善Klebsiella pneumoniae 1,3-丙二醇合成途径,本文利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli)中扩增出以NADPH 为辅酶的1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,从克雷伯氏杆菌中扩增出2.66kb的甘油脱水酶基因（dhaB）,构建了产1,3-丙二醇关键酶基因的串联载体pEtac-dhaB-tac-yqhD,并将其转入到野生克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)中,重组载体得到了表达。通过初步发酵,重组后的克雷伯氏杆菌产量比原始菌高20%左右,副产物中乙酸和丁二醇分别下降30%左右。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae ATCC49790)总DNA中扩增得到甘油脱水酶(glycerol dehydratase,DHAB)基因的DNA片段,并将其连接到表达质粒pSE380,携带有重组质粒pSE-dhaB的大肠杆菌JM109实现了dhaB基因的表达;对含有dhaB工程菌进行表达研究,表明工程菌在37℃,以1．0mmol／L IPTG诱导5h酶活力即达到1164．14u／L,比野生菌酶活力(168．69U／L)提高了6．9倍。     

克雷伯杆菌产1,3-丙二醇关键酶甘油脱水酶的酶活分析方法研究

有氧条件下,建立了克雷伯杆菌破碎方法及其生产1,3-丙二醇代谢途径中关键酶甘油脱水酶的酶活测定方法。甘油脱水酶酶活测定时在超声时间25min,功率为300w的条件下最适破碎频率为破碎时间1s,停息时间4s;甘油脱水酶酶活测定所用磷酸盐缓冲液的最适浓度为0.045mol/L,最适pH值7.2。甘油脱水酶酶活测定反应的最佳温度为37℃,甘油脱水酶酶活测定反应液的最佳吸收波长为290nm。     

重组大肠杆菌生物转化甘油生产3-羟基丙酸

目的:以甘油为底物构建高效的3-羟基丙酸生产菌株。方法:以自身携带乙醛脱氢酶的E.coli BL21(DE3)plysS作为宿主,异源表达源自Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶基因dhaB。结果:重组菌E.coli HP获得的甘油脱水酶比活力在1.0mmol/L IPTG的诱导下达到了77.2 U/mg,摇瓶条件下,3-HP的最大产量为5.44 g/L,摩尔转化率为53%,该产量比目前报道的最高水平(4.4 g/L)提高了23.6%。结论:重组菌株E.coli HP实现了甘油向3-羟基丙酸(3-HP)的高效生物转化。     

2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的编码基因,并测定其酶活性。方法:根据GenBank中05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增NagA(SSU05_1259)基因,将其克隆到pET28a载体中,构建重组质粒pET28a:NagA,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE与质谱鉴定;利用Ni亲和层析柱对表达产物进行纯化,获得NagA重组蛋白后测定其酶活性。结果:在大肠杆菌中高效表达了NagA基因,重组表达的Nag A相对分子质量约为43×10~3,其酶促反应最适温度为37℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH值为7.5,最佳底物浓度为13mmol/L。2型猪链球菌NagA的体外酶活为124U/mL,酶比活为78U/mg。结论:在原核系统中表达了NagA基因,获得的NagA蛋白具有良好的酶学活性。     

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株（BTC105）中克隆果胶裂解酶基因（PelC）完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希茵BL21（DE3）进行融合表达,在LB（Luria—Bertani）中进行摇瓶发酵,1mmol／LIPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导。结果表明,拘建了表达载俸pET28a－felC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5．4,最适温度为50℃,Ca^2＋对酶活促进作用最为明显,Cu^2＋完全抑制了酶的活性。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。     

重组大肠杆菌产Streptomyces sp. FA1来源木聚糖酶的摇瓶发酵优化

为了实现来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶的高效胞外分泌表达,对E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)/coe/xynA基因工程菌的发酵产酶诱导条件进行优化,获得最优的诱导条件为25 ℃发酵6 h后添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。在此基础上对发酵培养基进一步优化,得到最优培养基成分为:甘油11 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨8 g/L,磷酸盐浓度89 mmol/L,镁离子4 mmol/L。最终酶活达到780.2 U/ml,为未优化前的2.2倍,是目前大肠杆菌摇瓶发酵产木聚糖酶的最高表达水平,为实现该酶的工业化生产奠定基础。     

产1,3-丙二醇新型重组大肠杆菌的构建

利用PCR技术从大肠杆菌(Escherichia coli )中扩增出1.16 kb的编码1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD,将其连接到表达载体pEtac,得到重组载体pEtac-yqhD,重组载体在大肠杆菌JM109中得到高效表达。SDS_PAGE分析显示融合表达产物的分子量均为43 kD,同核酸序列测定所推导的值相符。对含有yqh-D的基因工程菌进行表达研究表明：37 ℃,以1.0 mmol /L IPTG诱导4 h,1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力达到120 u/mg蛋白,而对照菌株的酶活力为0.5 u/mg蛋白。再将含甘油脱水酶基因dhaB和含1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因yqhD的重组质粒共转化大肠杆菌JM109得到重组大肠杆菌JM109（pUCtac-dhaB, pEtac-yqhD）,该菌株在好氧条件下,以1.0mmol/L IPTG诱导可将50 g/L甘油转化为38.0 g/L 1,3-丙二醇。首次发现1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶在好氧条件下表现出较高的活性。     

分支杆菌噬菌体D29 Lysin B的表达、纯化及酶学性质分析

克隆表达噬菌体D29 LysinB(LysB)并对其酶学性质进行研究。以噬菌体D29基因组为模板,用PCR方法扩增lysB基因,与表达载体pET22b连接,将重组质粒转化至Escherichiacoli BL21(DE3)中表达,镍柱亲和层析(Ni-NTA)纯化可溶性表达产物,并对重组蛋白的活性进行分析检测。结果表明:成功构建了pET22b-lysB表达载体,并从1L的LB培养物中获得了33.2mg高纯度重组蛋白(His-LysB);His-LysB具有分解脂肪的能力,属于脂肪酶;生物化学特性分析表明:丁酸对硝基苯(pNPB)为水解底物,His-LysB热稳定性不佳,30℃以下比较稳定,随着温度的升高,稳定性逐渐降低;该蛋白具有较高的pH值适应性,pH5.0~9.5范围内稳定性较高;在23℃和pH7.5时酶活力最高,其比酶活为1.3U/mg;金属离子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制剂对酶活具有强烈的抑制作用。本研究为开发新的治疗结核药物提供了一个新的选择。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

临床分离肺炎克雷伯菌Ⅰ类整合子的结构与功能

为了探索细菌多重耐药性的产生和播散的分子机制, 文章对2002～2007年间179株临床分离的肺炎克雷伯菌进行耐药性、I类整合子可变区基因盒结构以及基因盒携带的耐药性基因进行分段克隆和耐药性功能测定。结果显示：65.9%(118/179)的肺炎克雷伯菌表现出对至少两种以上的抗生素(主要为β-内酰胺类、氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物)的耐药性; 36.3%(65/179)的菌株检出单条或者双条I类整合子基因盒条带; 对整合子阳性组与阴性组的耐药率进行比较发现, 除氨基糖苷类、喹诺酮类和复方新诺明等药物的耐药性存在显著性差异(P<0.01)外, 其余药物的差异不显著; 共发现15种耐药基因构成形式的整合子基因盒, 其中以dfrA17-aadA5最为多见, 实验证明整合子可由接合转移耐药性质粒携带; 对整合子基因盒(dhfr17-orfF-aadA2)分段克隆的耐药性功能研究发现, 3个克隆重组子(pET28a-dhfr17、pET28a-dhfr17-orfF和pET28a-dhfr17-orfF-aadA2)对复方新诺明的抗性(MIC值)均为256 µg/mL, 重组子pET28a-dhfr17-orfF与重组子pET28a-dhfr17对链霉素的抗性无明显区别, 和受体菌一样MIC值均为8 µg/mL, 而pET28a-dhfr17-orfF-aadA2对链霉素的抗性则明显提高, MIC值为256 µg/mL。结果表明, I类整合子在肺炎克雷伯菌中较常见, 携带氨基糖苷类和甲氧苄啶类的耐药基因盒在数量上占优势, 且整合子携带的耐药基因具有耐药性功能, 位于可水平转移耐药性质粒的耐药性基因相关的整合子对病原菌耐药性播散具有重要意义。 目的基因     

雷氏普罗威登斯菌青霉素G酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR和分子克隆技术从雷氏普罗威登斯菌（Prouidencia rettgeri)(ATCC29944)的基因组DNA中获得一个青霉素G酰化酶（penicillinGacylase,PGA)基因并将其装入表达质粒pET24a。携带有重组质粒pETPGA的Escherichia coli基因工程菌BL21（DE3）/pETPGA实现了PGA的高效表达,对发酵条件的研究表明基因工程菌在24℃,添加5g/L甘油条件下以1.0mmol/LIPTG诱导1.5h酶活力即达到993.4U/L,比野生菌酶活力（15U/L）提高了66倍。