麻类脱胶高效菌株果胶裂解酶基因克隆与表达

【目的】克隆麻类脱胶高效菌株Dickeya sp.DCE-01的果胶裂解酶基因并进行原核表达,对表达产物进行纯化和酶学性质研究。【方法】根据该菌株全基因组序列预测的果胶裂解酶基因Q59419设计引物,PCR扩增后将该基因连接到pEASY-E1和pACYCDuet-1载体上,导入E.coli BL21(DE3)进行表达。选择酶活力高的阳性克隆子进行大量诱导表达后,采用超滤和Sephadex G-100凝胶层析两步法纯化出果胶裂解酶,研究其酶学性质。【结果】克隆到果胶裂解酶基因pel(GenBank登录号:JX964997),其序列全长1 128 bp,编码375个氨基酸。pACYCDuet-1-pel-BL表达胞外果胶裂解酶活力最高,发酵液粗酶活达298.8 IU/mL。其最适反应温度为50°C,最适pH为9.0;保温1 h,酶活稳定温度≤45°C,稳定pH为9.0?10.0。酶催化作用依赖于Ca2+,其最适作用浓度为2 mmol/L;Zn2+、Ca2+和NH4+促进酶活力,Fe3+和Pb2+严重抑制酶活力;聚半乳糖醛酸钠为该酶的最适底物。【结论】从麻类脱胶高效菌株中发掘到碱性果胶裂解酶基因,其表达产物在生物质加工过程中具有重要工业化应用前景。     

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp．DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a（＋）中,构建重组质粒pET28a—COD（s＋）。以pET28a-COD（s＋）为底物,扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD（s-）。两种重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50％以上,Brevibacterium sp．DCR2DC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。     

构建羰基还原酶基因工程菌生物转化产l-麻黄碱

以筛选得到的Morganella morganii J-8细菌的基因组为模板,通过PCR扩增得到目的基因mdlh2。核苷酸序列测定结果表明,基因全长1046bp。以pET28a（＋）为表达载体,构建重组质粒pET28a（＋）-mldh2,并在E．coli BL21（DE3）中表达。利用表达产物进行生物转化,发现其具有催化底物1-苯基-2-甲氨基丙酮（简称MAK）产l-麻黄碱的活力。进一步考察了诱导时间和IPTG浓度对重组菌表达的羰基还原酶的影响,37℃下用0．5mmoL／L的IPTG诱导4h,重组羰基还原酶的酶活达到0．2U／mg蛋白,转化液中l-麻黄碱质量浓度达到45mg／L。     

Sul folobus sol fataticus P2嗜热嗜酸α-淀粉酶在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

通过PCR方法从Sulfolobus solfataticus P2中扩增到2．6kb的α-淀粉酶基因（SS01172）,将其分别克隆到表达载体pET32a（＋）和pPICZaA,并在E．coliRosetta和Pichia pastoris GS115中进行表达。结果表明α-淀粉酶基因在Rosetta中得到了高效表达,酶活为143．466U／mL;而在GS115中表达量稍低,发酵液酶活力为98．102U／mL。     

禾谷镰孢菌果胶裂解酶PelA的生物学功能分析

果胶裂解酶是果胶酶的重要成员之一,能够通过B-消除作用,催化降解（1—4）-α-D-聚半乳糖醛酸。本研究首次鉴定出禾谷镰孢茵中的一个果胶裂解酶PelA,并在体外检测了其生化特性。PelA基因（FGSG_02386）的cDNA被克隆并进行了原核表达,同时构建了单基因敲除突变体。将重组质粒pET-28a（＋）-PelA转化蛋白表达菌株大肠杆菌BL21表达目的蛋白,纯化后的蛋白具有果胶裂解酶活性。酶活性测定结果显示,该酶的活性受到外界环境因素如温度、钙离子浓度和pH条件的影响,其最适反应条件为50℃,CaCl：浓度0-5mmol·L^-1,pH8-5。在侵染小麦胚芽鞘时PelA单基因突变体的毒力较野生型菌株并没有出现明显变化。     

类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征

从类芽胞杆菌Paenibacillus sp.WZ008的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶,经SDS-PAGE电泳估算其亚基相对分子质量为4.5×104。通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果胶和高酯果胶;酶催化反应最适温度范围为55～60℃,最适pH为9.6,在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶活达3 021.6 U/mg;Ca2＋能增强该酶的活力,而Mn2＋,Ba2＋和EDTA强烈抑制该酶活力;当没有Ca2＋存在时,高度酯化的果胶是该酶的最适底物,在4 mmol/L Ca2＋存在时,该酶以果胶酸为底物比酶活最高（25 467 U/mg）。该酶N端序列比对分析发现与类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果胶裂解酶高度同源。     

淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的:克隆表达2型猪链球菌N-乙酰氨基葡糖-6-磷酸脱乙酰酶(NagA)的编码基因,并测定其酶活性。方法:根据GenBank中05ZYH33基因组序列设计引物,PCR扩增NagA(SSU05_1259)基因,将其克隆到pET28a载体中,构建重组质粒pET28a:NagA,转化至大肠杆菌BL21,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,产物通过SDS-PAGE与质谱鉴定;利用Ni亲和层析柱对表达产物进行纯化,获得NagA重组蛋白后测定其酶活性。结果:在大肠杆菌中高效表达了NagA基因,重组表达的Nag A相对分子质量约为43×10~3,其酶促反应最适温度为37℃,最佳反应时间为30min,最适反应pH值为7.5,最佳底物浓度为13mmol/L。2型猪链球菌NagA的体外酶活为124U/mL,酶比活为78U/mg。结论:在原核系统中表达了NagA基因,获得的NagA蛋白具有良好的酶学活性。     

黑曲霉（Aspergillus niger）F044脂肪酶新型基因lipB的克隆、表达及酶学性质分析

摘要：【目的】本研究拟克隆新型的黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶（EC 3.1.1.3）基因,实现其在大肠杆菌（Escherichia coli）的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。【方法】通过PCR和RT-PCR克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框（ORF）克隆入融合表达载体pET28a;表达产物经Ni-agarose纯化后对LipB进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。【结果】成功地从A. niger F044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB,获得了该基因的全基因组序列和cDNA序列（GenBank: FJ536287、FJ536288）,并实现了其在E. coli中的高效表达。LipB分子量约为43.0 kDa,最适底物为pNPC（C8）,酶学动力学常数Km=5.98 mmol/L,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;该酶能在40℃条件下保持稳定,在60℃条件下处理1 h后残余酶活仅为18.8%;该酶对Ca2+敏感,当脂肪酶经2 mmol/L Ca2+处理1 h后,酶活提高了2.6倍。圆二色谱分析表明该酶在Ca2+处理前后具有明显的结构变化。【结论】新型A. niger脂肪酶lipB基因的克隆不仅积累了脂肪酶基因资源,而且为高效基因工程菌的构建及规模化应用奠定基础;对LipB的酶学性质分析表明该酶在食品和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。     

肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究

本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究。首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究。经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a-3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD;纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1;其最适反应pH为7.0,最佳反应温度为30℃～37℃。本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础。     

海栖热袍菌极耐高温木聚糖酶基因xynB64在大肠杆菌中的融合表达

来源于极端嗜热菌海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8)的木聚糖酶B具有极高的热稳定性,在饲料、造纸、能源和食品医药行业具有巨大应用潜力。携带酶基因xynB64的pET28a(+)重组载体在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,重组酶活力较低。更换宿主为携带稀有tRNA基因的大肠杆菌:BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL和Rosetta(DE3)后,酶活力分别提高了197%和277%,但是后者中的表达会形成部分包涵体。宿主菌为大肠杆菌Rosetta(DE3),更换载体为4种融合表达载体pET32a(+)、pET42a(+)、pET43.1a(+)和pMAL-c2X进行表达,重组酶分别融合了Trx、GST、Nus和MBP标签。其中Rosetta(DE3)/pMAL-c2X-xynB64表达酶活力最高,相当于Rosetta(DE3)/pET28a-xynB64表达酶的88%,而且目的酶表达量占全细胞蛋白的40%,几乎不形成包涵体。     

生物转化法制备L-天冬酰胺

探索生物转化法制备L-天冬酰胺的技术与工艺。通过分子生物学方法,克隆来源于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)JM109的天冬酰胺合成酶A基因asnA,并于E. coli BL21(DE3)中表达,利用构建的E.coli基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA全细胞高密度催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺,以PITC柱前衍生-高效液相检测底物和产物。表达的蛋白质分子质量约为37kDa,与预期大小相符,比酶活力为1786.6U/g。L-天冬氨酸转化率为95.8%,L-天冬酰胺产量可达126.5g/L,生产速率为15.81g/(L·h)。结果表明,已成功构建高效表达天冬酰胺合成酶A基因工程菌株,并用于催化L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺,解决了L-天冬酰胺生物转化生产工艺中ATP成本过高的难题,为L-天冬酰胺制备提供新的绿色途径。     

应用分子伴侣共表达系统表达pfu基因及酶活性测定

将通过In-fution方法构建的pET32a-pfu质粒与可以促进可溶性表达的HG-PGR07质粒一起转入大肠杆菌B121（DE3）共表达,以pET32a-pfu单独在B121（DE3）中表达作为对照。用热变性和（NH4）2SO4沉淀去除部分杂蛋白,再经Ni—NAT亲和层析柱纯化分离尼血蛋白,SDS-PAGE检测结果表明目的蛋白大小约为90kD,与预计的分子量大小一致。最后对其酶活性测定结果表明分子伴侣能够促进pfu基因表达,并能够提高酶活性。     

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示。其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动予下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6．0。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

HIV—1gp41基因的高效表达及表达产物的纯化

为了获得高效表达的人类免疫缺陷病毒（ＨＩＶ１）ｇｐ４１蛋白,从而为ＨＩＶ１基因工程诊断抗原的国产化打下基础,用ＰＣＲ的方法从ＨＩＶ１全基因序列中扩增出编码ｇｐ４１Ｎ端的６９０ｂｐ片段。经酶切后,克隆到ｐＥＴ２８ａ载体中,再将重组质粒转化到表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导,高效表达出ｇｐ４１蛋白。间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＳＤＳＰＡＧＥ电泳证实,该表达产物具有良好的抗原性和特异性,且表达量约占总菌体蛋白的４５％。重组蛋白经金属鏊合纯化,纯度达９９％。     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...     

鲍曼不动杆菌铁蛋白的抗氧化功能研究

【目的】克隆鲍曼不动杆菌铁蛋白(Abferritin)基因,并研究其抗氧化功能。【方法】荧光定量PCR检测氧化应激下Abferritin基因的表达量,并将其基因克隆到表达载体p ET28a以构建重组质粒p ET28a-Abferritin,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌BL/p ET28aAbferritin,IPTG诱导目的蛋白表达并利用镍柱亲和层析纯化该蛋白。比色法测定Abferritin蛋白的Fe2+氧化酶活性,自由基清除实验测定其抗氧化功能。菌落计数法观察重组大肠杆菌在H2O2应激条件下的存活率。【结果】Abferritin基因在氧化应激下表达增高。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,通过Ni2+亲和层析纯化获得了Abferritin蛋白。该蛋白具有Fe2+氧化酶活性,能有效减少氧自由基的形成及提高大肠杆菌抵抗氧化应激的能力。【结论】氧化应激能诱导Abferritin基因表达上调,且该蛋白具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。     

右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

[目的]右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶.[方法]利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a( )上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG.[结果]经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制.通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0.酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一.[结论]酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力.