人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

单磷酸腺苷酸化修饰:一种蛋白质翻译后修饰方式

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能够通过Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion systems,T3SSs)分泌效应蛋白Vop S,催化三磷酸腺苷(ATP)分子中的单磷酸腺苷(AMP)通过磷酸二酯键共价连接至宿主细胞Rho鸟苷三磷酸激酶(Rho GTPases)成员蛋白Rho A、Rac1和Cdc42的特定的苏氨酸残基上,导致宿主细胞肌动蛋白骨架崩解,细胞变圆。该发现推动了一种蛋白质翻译后修饰方式——单磷酸腺苷酸化(AMPylation)修饰的迅速发展,其中催化AMPylation修饰的蛋白质称为单磷酸腺苷酸化酶(AMPylator)。目前的研究表明,与蛋白质的磷酸化修饰类似,蛋白质AMPylation在真核以及原核生物中都是一种重要的调控蛋白质功能的翻译后共价修饰调节机制。与AMPylation相对应的是去单磷酸腺苷酸化(de-AMPylation),即去单磷酸腺苷酸化酶(de-AMPylase)催化修饰后的蛋白质脱去AMP基团的过程,使底物蛋白重新恢复其原有的生物学功能。现就蛋白质AMPylation修饰的催化过程、AMPylation修饰的研究进展以及AMPylator/de-AMPylase的种类、物种来源、结构、功能和底物等方面的内容进行综合阐述。此外,就目前已有的AMPylation检测方法进行了总结,其中详细阐述了一种化学标记法的原理和过程。