转基因小鼠模型的载体构建和在人肝癌HepG2细胞中的表达

目的:构建转基因小鼠模型的载体并检测在人肝癌HepG2中的表达效果.方法:将n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1插入到真核表达载体(pcDNA3.1(+)myc-HisA)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-1,用脂质体介导的方法转染到人肝癌HepG2细胞中,RT-PCR检测fat-l基因的表达,MTT法分析fat-l基因对HepG2细胞增殖的影响,气相色谱分析检测fat-l基因对HepG2细胞n-6/n-3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)比例的影响.结果:成功地构建了真核表达裁体peDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,并能在HepG2细胞内有效异源表达.48h后可检测到fat-l mRMA的条带.与对照细胞相比,fat-l基因有效地抑制了人肝癌细胞HepG2细胞的增殖(70%,p＜0.01),降低了n-6/n-3 PUFAs比例.结论:pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-l重组载体构建成功并能在肝癌细胞中有效的表达,可以作为下一步转基因小鼠的合适载体.     

PA28γ及其胞浆定位突变体的构建及在肝癌细胞HepG2中的表达

目的：野生型PA28γ和核定位序列突变的PA28γ真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HepG2中的表达,为进一步研究PA28γ的功能提供实验基础。方法：采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γ cDNA开放阅读框全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,在该载体中利用定点突变获得核定位序列缺失的克隆。分别将野生型（WT）和突变型（MT）PA28γ克隆克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转染293T细胞确定两种克隆的细胞定位。再将野生型和突变型PA28γ分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中,构建好的真核表达质粒采用脂质体法转染人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选、Western Blot鉴定后,获得分别高表达野生型PA28γWT和PA28γMT的HepG2细胞系。结果：双酶切及DNA测序结果表明,成功克隆和构建了含PA28γWT和PA28γMT的pDsRed1-C3和pcDNA3.1(-)Flag重组质粒;荧光显微镜观察证实在293T细胞中pDsRed1-C3/PA28γWT定位在胞核中而pDsRed1-C3/PA28γMT定位在胞浆中;Western Blot检测HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γWT和HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γMT,证实所筛选的HepG2细胞高表达相应目标蛋白。结论：成功构建了高表达野生型PA28γ和胞浆定位PA28γ的HepG2细胞系,为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础。     

人类VIM基因的克隆和真核表达载体的构建

目的:构建VIM(Vimentin)基因的真核表达载体,以深入研究VIM的功能及其在相关疾病中的作用.方法:从人cDNA文库中,以RT-PCR方法扩增出1401bp的VIM编码区片段,胶回收后连接入T.载体,测序鉴定.再用Hind Ⅲ和BamHI双酶切,将VIM编码区片段定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,酶切鉴定重组质粒.将重组质粒转染NIH3T3细胞,分别以RT-PCR和Western Blot方法检测VIM的mRNA表达和蛋白表达.结果:将人VIM编码区基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中;继而转染NIH3T3细胞后,RT-PCR和Western Blot结果显示细胞可以表达VIM的mRNA和蛋白.结论:成功构建pcDNA3.1-VIM的真核表达载体,为进一步研究VIM基因的功能以及其在相关疾病中的作用奠定了基础.     

Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.     

GALNT14对人乳腺癌MCF-7细胞迁移的影响

构建真核表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,重组质粒经酶切分析及测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染人乳腺癌细胞系MCF-7细胞,经G418筛选并建立稳定转染GALNT14细胞株.应用半定量RT-PCR、Western blot检测稳定细胞株GALNT14 mRNA及蛋白表达水平,细胞划痕修复及穿膜试验检测GALNT14基因对MCF-7迁移能力的影响,同时RT-PCR检测GALNT14对MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF等肿瘤浸润转移相关因子表达的影响.结果显示成功构建了真核重组表达载体pcDNA 3.1-Flag-T14,经RT-PCR和Western blot检测显示成功获得了稳定表达GALNT14的MCF-7细胞株;GALNT14能够提高MCF-7细胞株的迁移能力,且能增加侵袭转移相关因子MMP-2,MMP-9,TGF-β1及VEGF的表达.结论:GALNT14可明显促进MCF-7细胞的迁移,可能在肿瘤侵袭转移中起重要作用.     

病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立

建立HIV-1的调节基因Nef基因在内皮细胞稳定表达的细胞株ECV304-Nef,为研究Nef对血管内皮细胞生物学活性的影响奠定试验基础。构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Nef,将其质粒和pcDNA3.1(+)质粒(阴性对照)分别转染血管内皮细胞ECV304,G418筛选。通过RT-PCR检测NefmRNA在细胞中的表达;细胞免疫荧光法检测Nef蛋白的表达及定位;Western blotting检测Nef蛋白的特异性表达,获得稳定表达的细胞株。构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符,分别为载体的5400bp和目的基因的621bp。测序结果显示碱基序列与GenBank(登录号:K03455)序列相同。转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的ECV304细胞株,RT-PCR显示转染pcD-NA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞出现621bp条带,对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。Western blotting结果显示,转染pcDNA3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞约27kD处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确。     

高表达蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST促进HepG2肝癌细胞体外增殖

为深入探讨蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST在肝癌中的作用, 构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/ PTP-PEST并转染HepG2肝癌细胞, 经荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞进行筛选, 选出稳定高表达PTP-PEST基因的细胞株, 并采用MTT及Western blot对高表达PTP-PEST基因的细胞株的增殖速度和生长因子受体结合蛋白2表达量进行检测, 观察到高表达PTP-PEST的细胞株内Grb2蛋白表达上调, 细胞增殖速度加快. 本研究表明, 在HepG2肝癌细胞株内, PTP-PEST可能通过影响Grb2蛋白的表达来促进细胞增殖.     

重组人凝血因子Ⅷ表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建含有B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ(B domain-deleted human FⅧ,BDDhFⅧ)的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法:将BDDhFVIII基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞,经Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达,持续培养获得稳定表达BDDhFⅧ蛋白的细胞株。结果:经限制性酶切和测序鉴定均证实重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ成功构建,在转染HepG2细胞后,Western blot检测证实人凝血因子Ⅷ可以在HepG2细胞中正确表达。结论:成功构建了人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并能在HepG2细胞表达目的蛋白。     

hAng-1真核表达载体的构建及其在MSCs中的表达

目的:通过基因重组技术,构建人血管生成素-1(human angiopoietin 1,hAng-1)真核表达载体体系,并将其转染至大鼠的骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)内进行培养,进而验证hAng-1的表达.方法:将hAng-1编码序列(互补脱氧核糖核酸)通过酶切,插入至pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点,构建质粒pcDNA 3.1 (+)/hAng-1真核表达质粒;重组质粒经脂质体介导转染鼠MSCs.应用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)等方法检测hAng-1的表达情况.结果:pcDNA 3.1 (+)/hAng-1真核表达质粒转染鼠MSCs后,应用流式细胞仪检测,转染效率约为15％.同时应用RT-PCR能够检测出目的基因mRNA,Western blot能够检出hAng-1的蛋白表达.结论:本实验通过基因重组技术,构建的pcDNA3.1 (+)/hAng-1真核表达载体能够在转染的鼠MSCs中表达,且表达较为持续,为hAng-1基因应用于基因治疗的研究奠定了基础.     

HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用

运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上.重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后, IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清.重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Western blot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达.通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍.通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1 mRNA发生了剪切.因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础.     

Canstatin基因转染对人肝癌HepG-2细胞体外血管生成拟态的影响

目的:探讨转染Canstatin基因对人肝癌HepG-2细胞体外形成血管生成拟态的影响。方法:将Canstatin基因通过脂质体法转染人肝癌HepG-2细胞,行G418筛选获得转基因细胞克隆。用SDS-PAGE电泳检测Canstatin蛋白在转基因细胞培养上清液中的表达;建立HepG-2细胞人工基底膜基质凝胶体外三维细胞培养模型,观察HepG-2细胞能否形成血管生成拟态,并比较转基因和未转基因细胞的管道形成能力。结果:Canstatin在转染人HepG-2细胞中表达并分泌至上清液中,人肝癌HepG-2细胞在体外三维培养条件下能够形成血管生成拟态。Canstatin基因转染HepG-2细胞组的管状结构数量高于空载体组和HepG-2细胞组,转染细胞管道形成能力明显受抑制。结论:人肝癌HepG-2细胞株可形成血管生成拟态,Canstatin能抑制人肝癌细胞株HepG-2体外血管生成拟态形成。     

人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

pcDNA3.1（＋）-LYVE-1真核表达质粒的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1融合基因表达质粒,观察其在COS-7细胞中的表达,为进一步探讨该标志物在肿瘤淋巴转移中的作用提供工具.方法 从本院结肠癌根治术患者术所取组织中的淋巴结抽提总RNA,RT-PCR扩增LYVE-1基因片段,并将其插入pMD19-T Simple Vector进行测序,鉴定正确后构建pcDNA3.1（＋）-LYVE-1并转染COS-7细胞,RT-PCR、Western印迹检测目的 蛋白表达,间接免疫荧光检测该基因表达在COS-7细胞上.结果 成功获取了人淋巴管内皮细胞特异标志物LYVE-1全长cDNA,构建了其真核表达载体pcDNA3.1（＋）-LYVE-1,转染COS-7细胞后检测出目的 蛋白的表达,并且证明该基因表达在细胞上.结论 成功构建了pcDNA3.1（＋）-LYVE-1重组质粒,为进一步研究LYVE-1在肿瘤淋巴管转移中的功能提供了重要的实验材料.     

MEKK3稳定表达细胞株的建立及其对A549细胞增殖的影响

目的 构建人MEKK3基因编码区序列（cDNA）的真核表达载体、建立其稳定表达细胞株并观察其对肺腺癌细胞增殖的影响.方法 从A549细胞中提取总RNA,应用RT-PCR扩增MEKK3 cDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/hygro（＋）质粒中,构建成MEKK3基因的真核表达载体,然后转染入人肺腺癌A549细胞中,潮霉素筛选稳定转染克隆,通过MTT实验,研究转染MEKK3基因前后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误,Western印迹检测结果显示MEKK3基因在A549细胞中具有良好的表达;荧光实时定量PCR结果表明MEKK3基因在其稳定转染的A549细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;MTT结果显示MEKK3表达上调的稳定克隆组,A549细胞的增殖活性显著增强（A570=0.876 1±0.074 5）,明显高于空载体稳定转染组（A570=0.582 8±0.070 3）及未转染亲代细胞组（A570=0.584 9±0.035 2）,差异具有统计学意义（P＜0.01）,而后两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 MEKK3表达上调可导致肺腺癌细胞的增殖增强.     

grp78真核表达载体构建及其稳定转染HeLa细胞系建立

目的构建人grp78基因真核表达载体,并建立稳定高表达grp78的人宫颈癌HeLa细胞系。方法用RT—PCR方法从人宫颈癌HeLa细胞中扩增grp78基因编码区,将PCR产物克隆到pcDNA3．1（＋）真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）／grp78并测序鉴定。用构建成功的pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体转染入人宫颈癌HeLa细胞,经G418筛选获得grp78稳定高表达的HeLa细胞系,并用RT—PCR及Western印迹方法鉴定。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／grp78真核表达载体,筛选获得稳定高表达人grp78的HeLa细胞系。结论grp78真核表达载体的成功构建和稳定高表达grpTS的HeLa细胞系的建立为进一步研究grp78的功能奠定了基础。     

HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用

运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上。重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清。重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Westernblot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达。通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍。通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1mRNA发生了剪切。因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv1884基因真核表达载体。方法:PCR扩增Rv1884基因,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);经酶切鉴定正确的重组质粒酶以阳离子聚合物转染P815细胞后,以RT-PCR方法检测mRNA的表达,以间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。结果:构建了重组质粒pcDNA-Rv1884;RT-PCR结果证明Rv1884可在P815细胞中转录;用间接免疫荧光检测,表达有Rv1884蛋白的细胞着染。结论:构建了结核分枝杆菌Rv1884基因的真核表达载体pcDNA-Rv1884,Rv1884基因可以在P815细胞中表达。     

PA28γ及其胞浆定位突变体在HepG2中的表达

本研究采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γcDNA全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,利用定点突变获得核定位序列缺失突变的PA28γ突变体,分别将野生型(WT)和突变型(MT)PA28γ基因克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转染293T细胞,荧光显微镜观察发现,在293T细胞中,PA28γWT定位在胞核中,而PA28γMT定位在胞浆中;再将野生型和突变型PA28γ基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中,用脂质体法將其转染HepG2細胞.Western印迹检测结果表明,PA28γWT和PA28γMT蛋白在HepG2细胞中获得了高效表达,建立了高表达PA28γWT和PA28γMT蛋白的HepG2细胞系.这些结果的获得,为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础.     

反义CD151基因转染对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151基因转染对培养的大鼠动脉平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响。方法构建携带全长正义和反义CD151的真核表达载体pcDNA3.1-CD151和pcDNA3.1-anti-CD151重组质粒,转染体外培养的VSMCs,以RT-PCR和Western blot方法检测CD151的表达,用Boyden趋化小室方法观察细胞迁移。结果与载体对照组、脂质体对照组和空白对照组3组均值比较,转染48h后,反义CD151组mRNA表达降低58%,蛋白表达降低51%,正义CD151组的VSMCs CD151mRNA表达增加171%,蛋白表达增加133%;趋化迁移的细胞数,反义CD151组为37.9±6.3,正义CD151组为86.5±12.4;载体对照组、脂质体对照组和空白对照组分别为60.3±7.1、61.8±7.6和67.3±9.6。反义CD151组显著低于其余各组(P<0.01),正义CD151组显著高于其余各组(P<0.01)。结论pcDNA3.1真核表达载体介导的反义CD151转染,通过抑制CD151的表达,能够显著抑制大鼠VSMCs的迁移。