PA28γ及其胞浆定位突变体的构建及在肝癌细胞HepG2中的表达

目的：野生型PA28γ和核定位序列突变的PA28γ真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HepG2中的表达，为进一步研究PA28γ的功能提供实验基础。方法：采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γ cDNA开放阅读框全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中，在该载体中利用定点突变获得核定位序列缺失的克隆。分别将野生型（WT）和突变型（MT）PA28γ克隆克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中，脂质体法转染293T细胞确定两种克隆的细胞定位。再将野生型和突变型PA28γ分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中，构建好的真核表达质粒采用脂质体法转染人肝癌细胞株HepG2，经G418筛选、Western Blot鉴定后，获得分别高表达野生型PA28γWT和PA28γMT的HepG2细胞系。结果：双酶切及DNA测序结果表明，成功克隆和构建了含PA28γWT和PA28γMT的pDsRed1-C3和pcDNA3.1(-)Flag重组质粒；荧光显微镜观察证实在293T细胞中pDsRed1-C3/PA28γWT定位在胞核中而pDsRed1-C3/PA28γMT定位在胞浆中；Western Blot检测HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γWT和HepG2/ pcDNA3.1(-)Flag/PA28γMT，证实所筛选的HepG2细胞高表达相应目标蛋白。结论：成功构建了高表达野生型PA28γ和胞浆定位PA28γ的HepG2细胞系，为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础。