肿瘤特异性蛋白B7-H4纳米抗体的筛选和鉴定

羊驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体,克隆重链抗体可变区(VHH),即可构建单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs),又称纳米抗体(nanobody,Nb)。利用非免疫羊驼噬菌体文库筛选肿瘤特异性蛋白B7-H4的纳米抗体,经过4轮淘选,ELASE鉴定阳性克隆噬菌体,测序获得其DNA序列后体外转录为mRNA,将修饰纯化后的mRNA转染到肿瘤细胞,利用细胞免疫荧光检测mRNA在肿瘤细胞内是否表达,Western印迹进一步验证其表达情况;通过CCK-8法鉴定其对肿瘤细胞的增殖抑制能力;划痕实验鉴定其对肿瘤细胞迁移能力的影响;Transwell法鉴定其对肿瘤细胞的侵袭能力的影响;裸鼠荷瘤模型瘤旁注射mRNA,鉴定其在体内实验对肿瘤组织的作用。结果显示,通过淘选获得1个高亲和性的噬菌体株菌H6;DNA测序并导出的氨基酸序列符合羊驼纳米抗体结构;将其mRNA导入肿瘤细胞,能有效表达出纳米抗体H6;转染H6-mRNA的肿瘤细胞(0.84±0.08)与未转染H6-mRNA的对照组(1.83±0.04)相比,其增殖能力明显受到抑制,P<0.01,其迁移和侵袭能力(78.60±5.36)明显低于空白对照组(197.80±21.04),效果优于B7-H4 mRNA的siRNA(95.40±16.56);在裸鼠乳腺癌模型中能有效抑制肿瘤生长,效果优于紫杉醇和B7-H4 mRNA的siRNA。这说明筛选所得抗B7-H4纳米抗体H6能特异结合B7-H4蛋白并封闭其功能,导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制。该结果为利用B7-H4作为治疗癌症的靶点提供了实验基础。     

转基因小鼠模型的载体构建和在人肝癌HepG2细胞中的表达

目的:构建转基因小鼠模型的载体并检测在人肝癌HepG2中的表达效果.方法:将n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1插入到真核表达载体(pcDNA3.1(+)myc-HisA)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-1,用脂质体介导的方法转染到人肝癌HepG2细胞中,RT-PCR检测fat-l基因的表达,MTT法分析fat-l基因对HepG2细胞增殖的影响,气相色谱分析检测fat-l基因对HepG2细胞n-6/n-3多聚不饱和脂肪酸(PUFAs)比例的影响.结果:成功地构建了真核表达裁体peDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,并能在HepG2细胞内有效异源表达.48h后可检测到fat-l mRMA的条带.与对照细胞相比,fat-l基因有效地抑制了人肝癌细胞HepG2细胞的增殖(70%,p＜0.01),降低了n-6/n-3 PUFAs比例.结论:pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-l重组载体构建成功并能在肝癌细胞中有效的表达,可以作为下一步转基因小鼠的合适载体.     

改变细胞膜的脂肪酸组成可促进乳腺癌细胞凋亡

目的: 研究n-6脂肪酸脱氢酶 fat-1基因在人乳腺癌细胞内的表达,改变细胞膜脂肪酸组成,对乳腺癌细胞的凋亡作用。方法: 构建含有fat-1 基因的重组腺病毒载体 (Ad.GFP.fat-1),通过包装细胞系（293）产生的腺病毒,感染人乳腺癌细胞MCF-7。提取细胞的总RNA,以fat-1的反义mRNA 作探针,用Northern Blot检测fat-1 基因在MCF-7细胞内的表达。MTT法分析fat-1 基因对MCF-7细胞增殖的影响,凋亡染色试剂盒检测细胞的凋亡。气相色谱仪分析对MCF-7细胞的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs含量影响。结果: 通过基因重组技术,得到预期的重组病毒;fat-1 基因在人乳腺癌细胞MCF-7 中能有效异源表达,2天后,可检测到fat-1 mRNA的条带。与对照细胞相比,fat-1基因有效地抑制了MCF-7细胞的增殖（23%,p<0.05）,促进了凋亡（增加35%）;同时降低了人乳腺癌细胞MCF-7细胞膜n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比率。结论: 腺病毒介导的fat-1 基因能在人乳腺癌细胞MCF-7内有效异源表达,且抑制了MCF-7细胞的增殖。机理为降低了细胞膜的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比率。     

n-6脂肪酸去饱和酶fat-1基因对神经元细胞凋亡的抑制作用

将C．elegans n-6脂肪酸去饱和酶基因fat-1的cDNA插入到腺病毒的穿梭载体pAd-CMV中,并与骨架载体同源重组,构建腺病毒重组体（Ad．GFP．fat1）,通过包装细胞系（293）产生重组腺病毒,感染原代培养的大鼠皮层细胞．在显微镜下观察、细胞增殖试剂盒（MTT）和凋亡染色试剂盒分析fat-1基因对大鼠皮层细胞凋亡的影响,核糖核酸酶保护性分析,检测fat-1基因在大鼠皮层细胞内的表达,酶联免疫分析花生四烯酸类（Eicosanoids）前列腺素（Prostaglandin E2）的含量．结果表明,通过基因重组技术,得到预期的重组病毒;fat-1基因在原代培养的大鼠皮层细胞中能有效异源表达,2d后,可检测到fat-1 mRNA的条带,与对照Ad．GFP细胞相比,fat-1基因明显抑制了大鼠皮层细胞因诱导产生的凋亡（35％）,受保护细胞的前列腺素含量也明显地减少（30％）．     

ω-6脂肪酸脱氢酶基因在乳腺癌细胞内的表达和作用

为探讨ω- 6脂肪酸脱氢酶基因fat -1在人类乳腺癌细胞MCF- 7中表达和对其生长的作用,将fat -1基因插入到腺病毒载体中,构建腺病毒重组载体(Ad·GFP·fat1) .通过包装细胞系(2 93)产生重组腺病毒,感染MCF 7细胞.用核糖核酸酶保护性分析技术,检测fat -1基因在MCF- 7细胞内的表达,细胞增殖试剂盒(MTT)和凋亡染色试剂盒染色分析fat 1基因对MCF- 7细胞增殖和凋亡的影响,用酶联免疫分析花生酸类(eicosanoids)前列腺素E2 (prostaglandinE2 )的含量.结果显示,腺病毒介导的fat- 1基因能在MCF- 7细胞内有效异源表达,抑制MCF -7细胞的增殖且导致凋亡,前列腺素的含量也明显地减少.结果说明,fat- 1基因在乳腺癌的基因治疗中具有良好利用价值.     

抑制VEGF基因表达对大肠癌细胞HT-29的增殖影响

选择血管内皮生长因子（VEGF）基因为靶基因,设计两组针对VEGF mRNA的小干扰RNA．合成DNA寡核苷酸链,体外转录合成siRNA．以人大肠癌细胞系HT-29为靶细胞,应用脂质体转染的方法,将siRNA导入细胞．MTT法检测siRNA对细胞增殖率的影响,RT—PCR法比较转染前后VEGFmRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化．结果表明,两组siRNA转染后均能有效地抑制HT-29细胞的生长,VEGF mRNA的表达量大幅度减少;相对应的VEGF蛋白水平也显著降低,而作为阴性对照的错义序列组siRNA转染后则无上述作用．     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

敲减血管内皮生长因子受体-2表达抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长

应用化学修饰的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)抑制裸鼠乳腺癌移植瘤血管内皮生长因子受体-2基因（VEGFR2,又称kinase insert domain-containing receptor, KDR)的表达, 探讨抑制肿瘤血管生成对人乳腺癌(MCF-7)裸鼠移植瘤生长的影响．雌裸鼠皮下种植MCF 7 细胞,肿瘤长至一定大小时, 随机分为对照组（A）、转染试剂对照组（B）、小剂量治疗组（C）及大剂量治疗组（D）．肿瘤局部分别注射葡萄糖溶液、In vivo jetPEI^TM转染试剂和In vivo jetPEI^TM转染试剂包裹的KDRsiRNA．22 d后处死全部动物, 取肿瘤, 测其大小及重量, HE 及免疫组化染色,微血管密度计数,同时用RT-PCR检测KDR基因的表达水平．结果显示,siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;HE染色显示,治疗组肿瘤中心区出现大面积细胞坏死;免疫组化结果显示,染色阳性血管数明显低于对照组;同时RT-PCR结果表明,治疗组KDR表达下调．对照组各指标无显著变化．因此,化学修饰的siRNA介导的RNAi可以降低人乳腺癌裸鼠移植瘤血管中KDR 表达, 抑制血管生成进而抑制肿瘤的生长,是潜在的肿瘤治疗新方法．     

乳腺癌SULT1A1、ICAM5基因单核苷酸多态性的研究

目的:探讨硫酸基转移酶(sulfotransferase,SULT)lA1、细胞间粘附分子(ICAM5)基因多态性与女性乳腺癌易感性的关系.方法:采外周血DNA后用等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)检测青岛市200例正常对照者和160例乳腺癌患者的SULTIA1、ICAM5基因多态性分布,并进行统计学分析.结果:(1)SULTlA1 Arg/Arg、Arg/His、His/His三种基因型分布在对照组和病例组之间的差异无显著意义(P=0.103);病例组、对照组His等位基因频率分别为19.5%和9.2%(P=0.039),此差别有统计学意义;在淋巴结转移方面SULTIA1基因三种基因型在阴、阳性组间的差异有统计学意义(P=0.038).(2)ICAM5基因各基因型及等位基因分布频率在病例组和对照组间的差异无显著意义(P=0.245,P=0.294);从临床病例分型方面进一步分析,基因型GG与携带变异基因A的GA及AA基因型相比差异均无统计意义.结论:SULTlA1 His等位基因与汉族女性乳腺癌的发生可能相关.     

应用siRNA技术探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的VEGF对树突状细胞的影响

为探讨MCF-7乳腺癌细胞分泌的血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）对树突状细胞（dendritic cell, DC）功能及其分化的影响,针对VEGF基因设计siRNA（small interfering RNA, siRNA),采用脂质体转染法以100 nmol/L最佳转染浓度导入MCF-7乳腺癌细胞（siRNA组）,以脂质体Lipofectamine　2000TM转染MCF-7 乳腺癌细胞培养上清培养正常DC作为对照（对照组）,采用ELISA法检测经siRNA 干扰VEGF基因后的MCF-7 乳腺癌细胞分泌的VEGF因子含量, Western 印迹检测VEGF蛋白表达,以探讨siRNA的基因沉默效果;以siRNA组和对照组培养上清分别培养外周血单个核细胞,用流式细胞仪检测所诱导DC表型CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,用MTT法检测转染前后两组DC 诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）对MCF-7细胞的细胞毒作用.结果显示,MCF-7 乳腺癌细胞培养上清能明显抑制正常DC分化成熟及抗原递呈能力,干扰VEGF基因后MCF-7 乳腺癌细胞培养上清对DC的影响明显降低,CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达较对照组显著升高,而CD1a表达下降（P＜0.01）.转染前后DC 诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤活性有明显差异（P＜0.01）.由此可见,siRNA可靶向抑制MCF-7乳腺癌细胞VEGF的表达,下调VEGF后的MCF-7 细胞上清对DC分化成熟及功能的抑制作用明显降低,从而推测VEGF在肿瘤的发生、发展和免疫抑制方面可能起着重要的作用.