HBV X基因的表达及在真核细胞中对内质网压力的作用

运用PCR技术获得HBx基因,分别克隆到原核表达载体pET-his和真核表达载体pcDNA3.1(-)上。重组质粒pET-his-HBx转化大肠杆菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达,利用Ni柱纯化后的蛋白免疫家兔,获得特异性的抗-HBx兔抗血清。重组质粒pcDNA3.1(-)-HBx分别转染HepG2和Hep3B细胞系后,经RT-PCR和Westernblot检测,证明HBx可以在这两种细胞系中表达。通过报告基因的表达研究了HBx对XBP1和GRP78启动子的激活活性,结果表明瞬时转染HBx的细胞系中,XBP1和GRP78启动子介导的荧光素酶活性比相应的对照细胞增加了3～7倍。通过RT-PCR分析证明,转染了HBx的细胞中XBP1mRNA发生了剪切。因此,可以初步推断HBx在HepG2和Hep3B细胞中的表达可以引起内质网压力反应,为进一步阐明HBx表达对内质网的影响和肝脏病原发生机制奠定了基础。     

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a.a～750a.a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株.在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB/c鼠.定期取免血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律.结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到13200.六周后,取鼠脾脏制备淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果.在ET=2001的情况下,杀伤率超过30%.这些结果表明工程菌株表达的HCV E2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答.由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者.     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1203bp-克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal Ⅰ线性化的pPIC9K—preS质粒用电击法导入巴斯德一毕赤酵母GS115His中。通过MD—G418平板筛选和5‘‘‘‘‘‘‘‘AOXI和3’AOXI引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长严preS基因的His^ Mut^ 酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长preS蛋白并可分泌到培养液中,SDS—PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的preS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应。     

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a．a-750a．a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株。在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB／c鼠。定期取兔血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律。结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到1：3200。六周后,取鼠脾脏制各淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果。在E：T＝200：1的情况下,杀伤率超过30％。这些结果表明工程菌株表达的HCVE2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答。由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者。     

HCV NS5A基因表达及其在血清学检测中的应用评估

Full-length NS5A gene of the hepatitis C virus was amplified by PCR using plasmid pBAC25 containing HCV nonstructural gene as template. The amplified fragment (about 1.34 kb) was cloned into plasmid pQE32, and the recombinant plasmid pQENS5A was expressed in JM109 strain. The NS5A protein was purified by NiSO4 metal chelating resin, and characterized by Western-blot. Its antigenecity was determined by ELISA. The positive detection rate of anti-NS5A was 75% (69/92) in ninety-two clinic sera. The positive rate of anti-NS5A was 82.5% (33/40) in fourty positive standand sera, and the negative rate of anti-NS5A was 100% (40/40) in fourty negative standand sera. The results showed that the Full-length NS5A proteinn had the higher sensitivity and specificity in the detection of HCV antibody in sera, we suggested that NS5A protein was a useful antigen for blood screening.     

TT病毒ORF2在Cos7细胞中的表达及蛋白质定位

应用PCR方法从含有1TrVirusORF2的质粒pET-His-TTV2中扩增出606bp的蛋白质编码区,并将其克隆到真核表达载体pEGFP．NI中以表达成GFP—VP2融合蛋白。构建出的重组质粒pEGFPTFV2经过酶切分析和PCR鉴定。用脂质体介导法将pEGFPTTV2质粒DNA转染Cos7细胞,通过RT-PCR分析,证实细胞中存在ORF2基因的转录产物。用共聚焦显微镜结合PI染色技术研究1TTV P2蛋白在细胞中的分布情况。结果表明,1TrVVP2分布在细胞质中和细胞核膜内侧。因此推测VP2作为一种非结构蛋白,功能可能是参与病毒DNA的复制或转录。     

精氨酸、精氨酸盐酸、半胱氨酸、胱氨酸对重组人tPA蛋白复性的影响

以重组人tPA蛋白为材料研究了精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸对蛋白质复性效果的影响,重组tPA蛋白包涵体经尿素变性溶解后,在精氨酸、精氨酸盐酸盐、半胱氨酸、胱氨酸存在的条件下进行复性,结果表明,碱性的精氨酸在质量分数0.2%时可减少蛋白质凝聚,显著提高复性效果,tPA复性后的活性可提高50%以上,半胱氨酸单独使用具有类似β-巯基乙醇的作用,精氨酸盐酸盐和胱氨酸单独使用对复性无影响,而半胱氨酸和胱氨酸联合使用,有类似氧化-还原系统作用。可提高活性20%。     

HCV NS5B蛋白对HCV RNA的模板特异性研究

在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达并纯化HCV的依赖于RNA的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp,NS5B蛋白).以HCV正、负链RNA 3′末端的序列为模板,体外研究NS5B蛋白催化的RNA合成.结果显示,正链RNA在体外不能指导RNA合成,而负链RNA模板可以产生一条全长的正链RNA产物,表明NS5B对负链RNA具有模板特异性.NS5B对负链RNA的特异性在模板竞争性实验中得到进一步证实,正链RNA的存在和竞争对以负链为模板的RNA合成没有影响.这样,就合理解释了在HCV RNA复制时正链RNA的数量远比负链RNA多这一问题.同时,本实验的结果也为进一步研究病毒或其它细胞因子参与以正链RNA为模板进行的RNA合成,以及有关负链RNA模板特性的研究奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B诱导细胞非折叠蛋白反应

用RT-PCR和免疫印迹的方法检测稳定表达NS4B的HeLa细胞中的XBP1;通过RT-PCR的方法在表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中检测ATF6,Grp78和caspase-12的转录,并且通过报告基因的方法分析XBP1和Grp78启动子活性.实验结果表明在表达NS4B的HeLa细胞中检测到XBP1的两种形式(剪接和未剪接),此外,在细胞中ATF6、Grp78的转录水平和XBP1、Grp78启动子的荧光素酶活性较没有表达NS4B的HeLa和Huh-7细胞中的量有所增加;通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)分析,这些增加可能是由于XBP1结合到了这些基因的启动子上引起的.总之,实验结果可提示HCV NS4B通过ATF6或XBP1途径引起内质网压力,导致UPR反应.NS4B可能在HCV的致病性中起着重要的作用,特别是在慢性肝炎,甚至肝细胞癌中.     

丙型肝炎病毒E2基因DNA 免疫实验动物研究

将编码丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白417～750位氨基酸的DNA片段克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(-)中的CMVIE启动子下游,构建成HCV E2重组真核表达质粒pcE2.ELISA法检测pcE2 DNA免疫兔血清中的E2抗体变化和维持规律,结果显示免疫20d已有抗体产生,30d后开始进入高峰,40d时达到最高值,至第90d抗体水平保持平稳,抗体滴度达到11600左右.流式细胞计数仪(FACS)检测pcE2 DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变化情况,与注射空载体pCDNA3.1(-)的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+细胞水平有较大升高,增幅达35.46%.免疫组化检测结果显示注射pcE2的小鼠组织中有明显的阳性着色,而注射pcDNA3.1(-)的对照组小鼠免疫组化结果为阴性.以上结果表明pcE2在实验动物内表达出的HCV E2蛋白可以引起免疫动物的体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其是MHC-1限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除病毒是十分有利的,因此HCV E2 DNA免疫有可能成为预防和治疗HCV感染的一条新途径.