人同源盒基因NKX3.1对前列腺癌细胞的诱导凋亡作用

构建人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体,研究其在前列腺癌细胞PC-3、LNCaP 中的表达及对细胞的促凋亡作用.以人前列腺癌细胞LNCaP细胞中的总RNA为模板,RT-PCR扩增NKX3.1基因全长编码片段,将NKX3.1 cDNA重组到真核表达载体pcDNA3.1（+）中; 将pcDNA3.1-NKX3.1表达载体瞬时转染前列腺癌细胞PC-3和LNCaP 细胞,用RT-PCR和Western印迹检测NKX3.1 cDNA在转录水平和蛋白水平的表达;绘制细胞生长曲线,观察NKX3.1对前列腺癌细胞增殖的抑制作用;用DNA/ladder和流式细胞术检测NKX3.1对前列腺癌细胞凋亡的影响,进一步用RT PCR检测凋亡相关基因caspase3、caspase8、caspase9、Apaf1、survivin和Bcl2表达的变化.人同源盒基因NKX3.1 cDNA真核表达载体pcDNA3.1-NKX3.1经酶切及测序鉴定正确. pcDNA3.1-NKX3.1转染PC-3和LNCaP细胞后,经RT-PCR和Western印迹证明能有效表达NKX3.1.生长曲线显示,前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA后细胞增殖受到抑制;前列腺癌细胞转染NKX3.1 cDNA 48 h后,DNA电泳呈现具有凋亡特征的DNA ladder;流式细胞术检测出现明显凋亡峰;RT-PCR检测凋亡相关基因.结果显示,caspase3、caspase8、caspase9基因表达明显增加,Bcl2基因表达明显减少.本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NKX3.1, 转染PC3和LNCaP细胞后能有效表达,并对细胞具有诱导凋亡作用     

抑制剂和猪粪对尿素氮在稻田土壤中转化的影响

为了阐明稻田土壤中尿素在配施抑制剂和猪粪的情况下不同形态氮的响应特征,探究不同管理措施下稻田土壤氮素保持和供给能力。本研究采用¹⁵N标记尿素进行盆栽试验,设置不施肥(CK)、猪粪(M)、尿素(N)、猪粪+尿素(NM)、尿素+抑制剂(NI)和尿素+抑制剂+猪粪(NIM)6个处理。抑制剂选用脲酶抑制剂(PPD+NBPT)和硝化抑制剂(DMPP)组合,测定返青期、分蘖期和成熟期土壤氮库的分配、尿素氮在氮库中的保存及水稻吸氮状况。结果表明: 施用猪粪显著提高了土壤铵态氮、固定态铵含量和微生物生物量氮,提高了分蘖期尿素氮在各氮库中的贮存,显著增加了水稻产量。与N处理相比,添加抑制剂促进了NH₄⁺的矿物固定和微生物对尿素氮的固持;与NM处理相比,施用抑制剂增加了黏土矿物对¹⁵NH₄⁺的固定。通径分析表明,施用猪粪能促进水稻吸收肥料氮,增加水稻产量;添加抑制剂可通过铵的矿物固定将更多的肥料氮暂时储存;NIM能将更多的氮贮存在微生物生物量氮中,至作物生长后期,铵的释放和微生物周转矿化可为水稻提供更多的有效氮源。在我国北方稻田,NM和NIM处理是推荐的施肥方式。     

p53过表达抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性

NKX3.1是前列腺特异表达的同源盒基因,在前列腺癌的发生发展中起重要作用,而在前列腺癌进展中常会发生p53的基因突变.为研究两者之间的关系,构建NKX-3.1启动子(1 040bp)-荧光素酶报告基因重组质粒（pGL3-1040）及其缺失突变体,瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP.通过荧光素酶表达活性分析,检测p53过表达对NKX3.1启动子活性的影响.结果表明：p53在LNCaP细胞中过表达可明显抑制NKX3.1启动子活性;RT-PCR及Western印迹检测p53过表达对NKX3.1表达的影响.结果表明,p53过表达可以明显抑制同源盒基因NKX3.1的表达.通过TRANSFAC软件分析,在NKX3.1基因上游-526至-507区存在一个p53反应元件的5′核心序列.缺失pGL3-1040中的p53反应元件核心序列并不能消除p53对NKX3.1启动子的抑制作用,表明p53不是通过p53反应元件直接抑制NKX3.1启动子活性.进一步通过5′缺失突变分析,发现NKX3.1启动子-140～+8 bp区仍受p53负调控.此148 bp区域中含有一个Sp1和一个CREB元件,瞬时共转染Sp1表达载体或CREB表达载体的结果表明,p53并不是通过与Sp1或CREB相互作用对NKX3.1启动子发挥抑制作用的.上述结果表明,p53过表达可以抑制同源盒基因NKX3.1启动子活性,下调NKX3.1基因的转录,其调控机制有待进一步研究.