腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达

构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

应用Ad Easy载体系统构建人β2-AR基因重组腺病毒

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人β2-肾上腺素能受体(β2-AR)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将β2-AR全长cDNA插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建pAdTrackCMV-β2AR重组质粒,经PmeI酶切线性化后经电击法转入含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测β2-AR的表达.结果:琼脂糖凝胶电泳显示在1242bp处有特异性条带后被克隆至腺病毒穿梭质粒.重组穿梭载体经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ限制性酶切可以得到目的条带并经测序证实.电击法转化BJ5183所得候选重组子经PacⅠ酶切后得到30Kb腺病毒基因组片段和4.5Kb氨苄抗性片段,证实获得同源重组质粒.转染293细胞可以看到绿色荧光蛋白,以MOI100转染SD大鼠心肌细胞发现携带β2-AR的腺病毒可以在心肌细胞中过表达.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人β2-AR基因的腺病毒,为进一步研究人β2-AR基因治疗奠定了基础.     

Gibson组装技术简化腺病毒载体反向遗传改造

重组腺病毒是常用的基因转移载体,本文介绍一种对腺病毒基因组进行反向遗传改造的策略。拟在维持基因编码蛋白氨基酸序列不变的前提下,突变去除重组人5型腺病毒Ad5GFP基因组的PmeI酶切位点。软件分析腺病毒质粒pAd5GFP序列,选择限制性内切酶BamHI将pAd5GFP切割为大小11.7和24.6kb两个片段,24.6kb大片段自身环化形成一个质粒pAd5GB,PmeI位于其上。PmeI/AscI双酶切pAd5GB质粒,产生2.4kb和22.2kb两个片段;在引物部位引入突变的PmeI位点(由gtttaaac突变为gtttaaaT),PCR扩增得到两端各延长30bp的上述2.4kb片段,与22.2kb片段进行Gibson组装,转化E.coli TOP10感受态细胞,得到pAd5GBXP质粒。BamHI酶切pAd5GBXP,碱性磷酸酶处理,与11.7kb片段连接,还原得到腺病毒质粒pAd5GXP。PacI线性化pAd5GXP质粒,转染293细胞,拯救得到Ad5GXP病毒;酶切分析证明Ad5GXP基因组不含有PmeI位点。研究结果说明将酶切连接与DNA组装技术相结合,能够方便灵活地对腺病毒基因组进行突变改造。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

MEKK3基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞MEKK3的表达抑制

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体表达载体,观察其在胃腺癌AGS细胞中对MEKK3的表达抑制。方法设计并合成针对人MEKK3基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluI及XhoI克隆入pRNAT—H1．1／Adeno穿梭载体中,得到的质粒用Pme I线性化后在大肠埃项菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组。卡那霉素筛选后,用PacI酶切鉴定。鉴定正确的质粒经Pac I酶切、乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒。病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western印迹法检测其对MEKK3蛋白表达的抑制。结果酶切和洲序鉴定表明3个MEKK3 siRNA重组腺病毒表达载体正确无误。Western印迹检测结果显示3个pAd—MEKK3-siRNA重组腺病毒表达载体中有两个可有效地抑制胃腺癌AGS细胞中MEKK3基因的表达,其中以pAd．MEKK3-siRNA3的抑制作用最显著,有效率达89％。结论成功构建了针对MEKK3基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究MEKK3基因在人胃腺癌AGS细胞中的作用和功能奠定了基础。     

重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-Akt1构建及鉴定

目的:构建大鼠Akt1-p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒并鉴定其蛋白表达。方法:提取SD大鼠海马总RNA,利用RT-PCR方法扩增大鼠Akt1的c DNAs,将其亚克隆入T载体,双酶切鉴定后将其与经过同样处理的腺病毒穿梭质粒载体p Ad Track-CMV连接,经酶切和测序进行鉴定。将p Ad TrackCMV-Akt1转染293细胞,免疫印迹鉴定Akt1的表达。结果:成功克隆出Akt1目的基因,并将其亚克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV。免疫印迹结果显示,转染p Ad Track-CMV-Akt1的细胞中能检测出Akt1的特异性条带。结论:成功构建重组大鼠Akt1腺病毒穿梭质粒,且其在真核细胞中能高效表达。     

应用Ad Easy腺病毒载体系统构建人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)

目的:利用Ad easy腺病毒表达系统构建含人肌浆网钙离子ATP酶2a(SERCA2a)基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组腺病毒.方法:将人SERCA2a基因全长c DNA(3700bp)插入到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,成功构建pAd-TrackCMV SERCA2a重组质粒,经Pme I酶切线性化,采用电击法转入到已含Ad easy质粒的电感受态菌BJ5183进行重组.挑选同源重组质粒,Pac I酶切线性化转染HEK293细胞包装成重组腺病毒颗粒,荧光检测有绿色荧光蛋白表达.将重组病毒和SD大鼠心肌细胞共培养,western-blot检测SERCA2a可以在大鼠心肌细胞过表达且影响了胞内SERCA2a的活性.结果:成功包装含人SERCA2a基因的重组腺病毒,并可以有效感染SD大鼠心肌细胞.结论:利用新型腺病毒载体在短时间内成功构建了携带有人SERCA2a基因的腺病毒,为以后进一步研究人SERCA2a基因治疗提供了新途径.     

汉坦病毒包膜糖蛋白G2重组腺病毒的构建及其在Hela细胞中的表达

本研究旨在构建可表达汉坦病毒(HTNV)糖蛋白G2的重组腺病毒。应用PCR方法扩增G2编码基因,经T/A克隆、测序鉴定后再亚克隆到腺病毒shuttle载体pAd5-CMV中并用磷酸钙沉淀法分别将携带G2编码基因的重组腺病毒shuttle载体与携带报告基因eGFP的腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装、扩增、纯化后得到携带HTNV糖蛋白G2编码基因的重组腺病毒;用重组腺病毒感染Hela细胞并收获蛋白,间接免疫荧光、Western blotting检测蛋白表达。经酶切鉴定表明已成功构建了携带G2基因的重组腺病毒载体;RT-PCR鉴定表明目的基因能够在感染重组腺病毒的Hela细胞中转录;荧光显微镜观察重组腺病毒感染的Hela细胞,可见报告基因eGFP的表达;间接免疫荧光法和Western blotting均证实表达产物可被抗G2单克隆抗体所识别,表明糖蛋白G2在感染细胞中得到了表达。本研究成功构建了可表达HTNV包膜糖蛋白G2的重组腺病毒,转染宿主细胞可稳定表达目的蛋白,为HTNV糖蛋白G2的结晶、结构解析研究以及新型汉坦病毒疫苗的研制奠定了基础。     

PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达

目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达.方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆.经筛选阳性表达克隆并测序验证后,Pacl酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒.病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞.用Western blot技术检测PRKAG2蛋白的表达.结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108 pfu/ml.荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达.结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础.     

P27特异性siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性皿7基因表达的影响。方法合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用NotI和HindHI限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle—H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd—P27-siRNA和pAd—NC重组腺病毒。用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平。结果重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达。结论成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础。     

抑癌基因Fhit重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

目的：构建携带抑癌基因Fhit的重组腺病毒并通过其研究Fhit蛋白对结直肠癌细胞增殖能力的影响。方法：利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段,Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后,将基因片段导入ptrack-CMV穿梭质粒中,构建重组穿梭载体ptrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ 单酶切线性化的ptrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌,使ptrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit,将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞,采用蛋白印迹法检测外源Fhit蛋白的表达,并进一步观察其对细胞增殖能力的影响。结果：我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒,且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中,Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。结论：在结肠癌细胞中,Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色,而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。     

仙台病毒BB1株6个编码基因的克隆及表达

在仙台病毒BB1株全基因组序列测定的基础上,用反转录和PCR方法获得了核蛋白基因(N),磷蛋白基因(P),神经血凝素基因(HN),基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)和聚合酶蛋白基因(L)等6个编码基因全长克隆;测序结果表明,其序列与Genbank中登录的序列(DQ219803)完全一致。为了提供仙台病毒基因组载体拯救和包装所需的反式作用蛋白,将N、P、M、F、HN和L分别克隆到腺病毒穿梭表达载体pDC316上,将它们分别与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,获得了6种复制缺陷性重组腺病毒Ad5-N、Ad5-P、Ad5-M、Ad5-F、Ad5-HN和Ad5-L。酶切结果表明6种重组腺病毒穿梭质粒构建正确;用PCR方法证明所获得的6种重组腺病毒分别携带了上述6个编码基因;用重组腺病毒感染LLC-MK2细胞后用Western blotting和免疫荧光方法检测到了相应仙台病毒编码基因的表达。本研究为仙台病毒BB1株全长基因组的拼接和病毒载体包装系统组建打下了基础。     

pAd—SIG腺病毒质粒构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的含人生长抑素受体2亚型（ human somatostatin receptor subtype 2, hSSTr2 ）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）的腺病毒重组质粒的构建及表达。方法采用PCR方法将hSSTr2以及IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle—CMV中,获得pShuttle-CMV／hSSTr2-EGFP,经PmeI酶切,去磷酸化后转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183菌,细菌内同源重组构建腺病毒质粒pAdeasy-1／hSSTr2．EGFP（pAd．SIG）,将其转染HEK293细胞进行病毒包装与滴度测定。重组腺病毒感染MCF-7细胞,流式细胞术检测其表达。结果酶切、PCR及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd-SIG构建成功,病毒滴度为8．2&#215;10^9 IU／ml,流式细胞术结果显示hSSTr2在MCF-7细胞中表达阳性率为86．59％。结论成功构建了区组腺病毒质粒pAd-SIG,并能在真核细胞表达,为体内外研究hSSTr2效应提供了基础。     

小鼠FAM3C基因重组腺病毒载体的构建及其在肾系膜细胞中的表达

目的:利用Ad Easy TMsystem构建携带小鼠FAM3C基因的重组腺病毒,转染至人胚肾细胞系HEK293细胞,检测外源FAM3C在细胞中的表达。方法:取小鼠肾脏提取RNA,创建c DNA文库,用PCR的方法扩增FAM3C基因,将其克隆到p EASY-1载体中,T3连接酶连接。经Bgl II单酶切后,接入p Ad Tra Ck-CMV穿梭载体,T4连接酶连接,构建重组腺病毒的穿梭质粒p Ad Tra Ck-CMV-FAM3C。将经Pme I线性化的p Ad Track-CMFAM3C电穿孔共转化入BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒Ad-FAM3C,再将经Pac I线性化的Ad-FAM3C重组病毒骨架质粒转染人胚胎肾细胞系HEK293细胞,包装并扩增病毒。用Ad-FAM3C感染小鼠肾系膜细胞,Western blot法检测FAM3C在小鼠肾系膜细胞中的表达。结果:DNA序列分析和琼脂糖凝胶电泳结果表明,已构建表达FAM3C基因的重组腺病毒,该腺病毒在体外能有效感染小鼠肾系膜细胞,且高表达FAM3C蛋白。结论:成功地构建了携带小鼠FAM3C基因的重组腺病毒,为进一步阐明FAM3C的功能及作用机制奠定实验基础。     

脂肪储存小滴蛋白5 重组腺病毒的制备

目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

脂肪储存小滴蛋白5重组腺病毒的制备

目的：利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5（LSDP5）基因的重组腺病毒。方法：从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果：LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论：成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白。方法PCR扩增,获得HIV-1C亚型gp120片段,定向克隆人腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd—gp120,PacI酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd—gp120。结果经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd—gp120重组腺病毒;通过Western印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120kD的蛋白。结论成功构建了含有HIV-1C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达。     

一种经miniSOG标记的人腺病毒的制备

为了探索腺病毒感染细胞后病毒核心在胞内运输的过程,本研究构建了一株经miniSOG标记IX蛋白的人腺病毒。首先,我们通过重叠延伸PCR的方法合成了miniSOG基因,将其克隆至pcDNA3表达载体后转染293细胞,荧光显微镜下可观察到miniSOG蛋白的表达,经固定,封闭,DAB-H2O2染色,OsO4固定染色后,可见表达miniSOG蛋白的细胞呈深褐色。之后将miniSOG构建至腺病毒穿梭载体pShuttle的IX基因3’端,并通过与骨架质粒pAdeasy-1在E.coli BJ5183细菌内同源重组获得了重组腺病毒质粒pAd5-IXSOG。pAd5-IXSOG质粒经PacI酶切线性化后转染293细胞,拯救出重组腺病毒HAdV-5-IXSOG。经过8轮扩增,超速离心纯化后获得2.0ml浓度为6.0×1011vp/mL的重组腺病毒,电子显微镜下可见完整病毒颗粒。本研究经反向遗传学技术对腺病毒载体进行改造,成功制备了经miniSOG标记的重组腺病毒HAdV-5-IXSOG,该病毒可用于腺病毒感染细胞的实时追踪。     

小鼠SOCS1基因重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞中的表达

目的:构建含小鼠细胞因子信号抑制因子-1基因(SOCS1)的重组腺病毒载体(Ad5F35-SOCS1),探讨其介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。方法:设计含AgeI和NheI酶切位点的SOCS1基因上下游引物,以质粒pEF-FLAG-1/mSOCS1为模版,通过PCR扩增获得SOCS1全部序列,片段回收后经AgeI和NheI酶切,再定向插入到经AgeI和NheI酶切的质粒pDc316-LacZa中,获得重组穿梭质粒pDC316-SOCS1,经AgeI和NheI酶切、PCR及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-SOCS1与腺病毒骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad5F35-SOCS1,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。用获得的重组腺病毒感染小鼠树突状细胞,以免疫组化检测SOVD1的表达。结果:成功构建了含小鼠SOCS1基因的重组腺病毒载体,病毒感染滴度为1.4×10~9IU/ml,该载体能有效介导SOCS1基因在小鼠树突状细胞中的表达。结论:重组腺病毒载体能将SOCS1基因转入小鼠树突状细胞并有效表达,为基因转染制备耐受性树突状细胞奠定了基础。