MiR-15b促进急性早幼粒细胞白血病细胞分化并抑制增殖

该文探讨了miR-15b在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)过程中发挥的作用。采用实时荧光定量PCR检测miR-15b的表达;流式细胞术检测细胞的分化情况; CCK-8实验检测细胞增殖;双荧光素酶报告实验检测miR-15b与CCNE1 3′UTR端的结合能力; Western blot检测下游靶基因CCNE1的表达。结果显示,ATRA促进miR-15b的表达;过表达miR-15b增强了ATRA对APL细胞的分化作用,而抑制miR-15b表达后则出现相反结果; miR-15b抑制了APL细胞的增殖能力;双荧光素酶报告实验显示miR-15b与CCNE1的3′UTR端结合; Western blot显示mi R-15b可以抑制下游靶基因CCNE1的表达。这些结果表明, miR-15b通过抑制CCNE1的表达促进APL细胞分化,抑制细胞增殖。     

miR-382-5p通过靶基因PTEN阻滞NB4细胞分化

该文主要研究在急性早幼粒细胞白血病NB4细胞中, miR-382-5p通过调控靶基因PTEN(phosphatase and tensin homologue)抑制了全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)诱导的急性早幼粒细胞分化。我们运用ATRA(1μmol/L)诱导细胞分化; Western blot检测PTEN及髓系分化标志物CD11b的蛋白质水平;实时荧光定量PCR检测miR-382-5p的表达水平;过表达PTEN的慢病毒载体分别感染NB4细胞和HL-60、THP-1细胞;脂质体转染miR-382-5p的模拟剂(mimics)和特异性抑制剂(inhibitors)NB4细胞。结果显示, PTEN促进ATRA诱导的NB4细胞分化,而在HL-60和THP-1细胞中并无明显促分化效应。NB4细胞中,脂质体转染miR-382-5p mimics在mRNA和蛋白水平均抑制了PTEN的表达,并且抑制了ATRA诱导的分化;转染miR-382-5p inhibitors则恢复了PTEN表达,同时促进了ATRA诱导的急性早幼粒细胞NB4细胞的分化。该文结果提示, miR-382-5p靶向抑制了PTEN的表达从而抑制ATRA诱导的NB4细胞分化。     

NPM1突变基因表达抑制K562白血病细胞体外增殖和侵袭

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突变是近年发现的在急性髓系白血病中发挥重要作用的基因改变,为探讨NPM1突变对K562白血病细胞体外增殖和侵袭能力的影响,将载体pEGFPC1-NPM1-mA转染K562细胞系,构建稳定表达NPM1突变蛋白的白血病细胞株(K562-mA)。利用细胞生长曲线观察细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期进程改变;细胞粘附、Transwell实验分别用以观察细胞体外粘附、迁移及侵袭能力。结果发现,NPM1突变转染后K562细胞体外增殖能力明显减弱;同时G1期细胞比例明显增高,S期细胞比例显著减低。与未处理组和空载体转染组细胞相比,K562-mA细胞体外迁移能力有所增加,但细胞粘附及侵袭能力却明显减弱。提示NPM1突变基因的表达能够抑制白血病细胞体外增殖和侵袭能力,为进一步深入探讨NPM1突变在白血病发生发展中的调控机制奠定了良好的基础。     

维替泊芬通过抑制YAP诱导白血病NB4细胞凋亡

探讨维替泊芬对人类白血病NB4细胞活性、凋亡的影响及其作用机制。我们用CCK-8实验检测NB4细胞的增殖活性;集落形成实验检测NB4细胞的集落形成能力;细胞周期和凋亡用流式细胞术来检测;凋亡形态学用Hoechst33342染色来观察;以及Western blotting检测细胞中蛋白的表达水平。结果显示,NB4细胞经维替泊芬处理后,集落数量减少,集落大小减小;CCK-8结果提示细胞增殖活性受到显著抑制,且呈现出剂量和时间依赖性(p0.05);Hoechst 33342染色后观察到细胞凋亡形态;流式检测到G0/G1期细胞明显增多,细胞凋亡率明显增加(p0.05);Western blotting检测到YAP、GSK3β、p-AKT、cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平明显下调,Bax、p-GSK3β表达明显增加,裂解的PARP蛋白明显增加(p0.05)。因此本研究提示,维替泊芬能抑制人类白血病NB4细胞的增殖,诱导细胞凋亡。其机制是通过抑制YAP蛋白的表达诱导细胞凋亡,AKT/GSK3β信号参与了这一过程。     

PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证

目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转人酵母AH109,培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里,然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293）,最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。     

NLS-RARα蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特征性染色体易位,产生的PML-RARα融合基因在其发生发展中有重要作用．PML-RARα融合蛋白在细胞内被中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)切割为PML突变蛋白(核定位信号NLS缺失)和RARα突变体 (NLS-RARα,包含有PML的核定位信号),这两段蛋白质在APL的发生中可能具有重要作用．为进一步研究NLS-RARα的生物学功能,运用酵母双杂交技术在白血病cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质．首先PCR技术扩增NLS-RARα编码序列,克隆至诱饵载体pGBKT7,测序鉴定后将其转化酵母AH109．免疫印迹检测到诱饵蛋白表达后,将含有诱饵载体的AH109与含有白血病cDNA文库的酵母Y187交配,在含有X-α-gal的营养缺陷性培养基上选择和筛选二倍体酵母．经回转实验和测序分析验证得到8个与NLS-RARα相互作用的蛋白质．为进一步验证这些相互作用,克隆其中的JTV-1蛋白,利用间接免疫荧光,GST pull-down和免疫共沉淀技术成功验证了它与NLS-RARα的相互作用．为进一步探讨APL的发生机制提供了新的线索．     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

PML（NLS^-）蛋白在NB4细胞及其裸鼠移植瘤中定位的验证

验证中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）切割PML—RARa后,PML（NLS-）蛋白的存在和定位。将质粒pCMV-HA—NE电转染NB4细胞,用Westemblot法验证质粒转染成功;提取电转染质粒成功64／NB4细胞的胞浆蛋白,用Westem blot法检测NB4细胞中PML（NLS^-）蛋白的表达;免疫荧光法和激光共聚焦检测电转染质粒成功的NB4细胞中PML（NLS^-）蛋白的表达及定位;同时,建立NB4细胞、K562细胞和电转染质粒成功的NB4细胞裸鼠皮下瘤模型,用Westem blot、免疫组化法检测PML（NLS^-）蛋白在移植瘤组织细胞中的表达与定位。结果表明,westemblot检测电转染质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞成功表达NE蛋白：NE酶成功切割PML-RARα,Western blot检测到电转染质粒pCMV-HA-NE的NB4细胞表达PML（NLS^-）蛋白;免疫荧光和激光共聚焦均可检测到电转染质粒成功的NB4细胞中PML（NLS^-）蛋白定位于细胞胞浆：Westem blot和免疫组化法检测到电转染质粒成功的NB4细胞裸鼠移植瘤中的PML（NLS^-）蛋白的表达且定位于细胞胞浆,而NB4和K562细胞裸鼠皮下瘤中PML蛋白主要定位于胞核。综上所述,该文成功将质粒pCMV-HA—NE电转染NB4细胞并用Western blot、免疫荧光、激光共聚焦、免疫组化验证PML（NLS-）蛋白存在于NB4细胞胞浆,这一现象可以为急性早幼粒细胞白血病的临床早期诊断与治疗提供新的依据。     

酵母双杂交技术筛选并回转验证在胞内与PML-C结构域相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术在活细胞内筛选并回转验证与PML-C结构域相互作用的蛋白质.方法 通过诱饵质粒pGBKT7-PML-C,利用酵母双杂交系统从白血病细胞cDNA文库中筛选与PML-C结构域相互作用的蛋白质.结果 利用酵母双杂交技术筛选到43个能与PML-C结构域相互作用的克隆;经进一步的归类与酵母回转试验得到9个阳性克隆.结论 在细胞内PML-C结构域能与多种蛋白质有相互作用.中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）介导的急性早幼粒细胞白血病的发生可能与这些相互作用所致的生物学功能改变有关.