抗人胎盘酸性铁蛋白单链抗体的构建、表达与鉴定

目的:制备人胎盘酸性铁蛋白(PAF),构建、表达并鉴定抗人PAF单链可变区抗体片段(scFv)。方法:设计以SfiⅠ、NotⅠ为酶切位点、以(Gly4Ser)3为linker的2对引物,从抗人PAF单克隆抗体可变区基因的克隆载体中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,构建VH-linker-VL的scFv基因。经SfiⅠ、NotⅠ酶切后克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化大肠杆菌TG1和筛选后测序验证,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量(Mr)。以人PAF为抗原,scFv为一抗,抗His单克隆抗体为二抗,间接ELISA鉴定其抗体活性。结果:重叠延伸PCR扩增产物经凝胶电泳可见约700bp的条带,DNA序列分析证明2株抗体具有完整的scFv序列,并含有c-myc和His。IPTG诱导阳性菌表达产物经SDS-PAGE鉴定有Mr约27000的显示条带,符合scFv与表达标签融合蛋白的理论值;间接ELISA证明表达产物可与PAF结合。结论:成功构建并表达了抗人PAF单链抗体,为进一步建立检测PAF的间接ELISA奠定了基础。     

4种常见金鱼骨骼形态学观察

本研究以金鱼的4个典型品种为实验对象,分析了其骨骼形态与游泳能力的关系。草金鱼两侧腹肋夹角较小且躯椎、尾椎平直,其骨骼结构支撑其纺锤形的外部形态,使草金鱼具有较强的运动能力;琉金、虎头、龙睛蝶尾金鱼的内部骨骼形态,使其不具纺锤形的外形,多叶尾鳍的推动力也较弱,在水中游动的能力也弱于草金鱼;虎头金鱼背鳍的消失(退化)以及"∩"形的尾鳍骨骼形态,导致其运动、平衡能力较弱。     

嗜冷产甲烷菌及其在废水厌氧处理中的应用

嗜冷产甲烷菌对于自然界的碳素循环具有非常重要的意义,近年来引起了国内外学者的广泛关注.利用嗜冷产甲烷菌实现低温厌氧生物处理过程,可从本质上突破低温厌氧工艺的技术瓶颈,进而大大拓展厌氧生物处理技术的应用范围并降低废水处理的成本.本文针对研究者广泛关注的热点问题,从分离培养及生理生化特性、适冷机制和分子生物学研究几个方面,对嗜冷产甲烷菌的研究进展进行了全面的综述,并对其在低温厌氧生物处理技术中的应用前景进行了分析和展望.     

饲料脂肪水平对杂交鲟幼鱼生长、饲料消化率、抗氧化水平和肌肉脂肪酸组成的影响

研究旨在探究饲料中不同脂肪水平对西伯利亚杂交鲟(Acipenser baerii Brandt ♀ × A. schrenckii Brandt ♂)幼鱼生长、饲料消化率、血清生化指标及肌肉脂肪酸组成的影响。以鱼油为脂肪源, 配制4种脂肪水平分别为5%(D05)、10%(D10)、15%(D15)和20%(D20)的等氮饲料。选用初始体重为(152.83±0.67) g的杂交鲟, 随机分为4组, 每组3个重复, 每个重复25尾鱼。养殖周期为12周。结果显示, 饲料中不同脂肪水平对杂交鲟的生长性能有显著影响(P<0.05)。其中, D15组杂交鲟幼鱼的末均重(FBW)、增重率(WGR)和特定生长率(SGR)显著高于D05、D10和D20组(P<0.05), 饲料效率(FE)显著高于D05和D10组(P<0.05)。随着饲料中脂肪含量的增加, 杂交鲟幼鱼脏体比(VSI)、肝体比(HSI)及肌肉、肝脏中的脂肪含量显著上升(P<0.05)。饲料中不同脂肪水平对干物质(ADC_d)、蛋白质(ADC_p)表观消化率无显著影响(P>0.05)。D10、D15和D20组脂肪表观消化率(ADC_f)显著高于D05组(P<0.05)。D15组能量表观消化率在各组中最高, 显著高于D05和D10组(P<0.05)。随着饲料中脂肪水平的增加, 血清超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和髓过氧化物酶(MPO)的活性均显著升高, 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著下降(P<0.05)。此外, 肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性也随饲料中脂肪水平的升高呈递增趋势(P<0.05)。肌肉中的各脂肪酸含量与饲料中脂肪酸含量呈显著的线性正相关(R2>0.90, P<0.05)。综合各指标因素判断, 西伯利亚杂交鲟幼鱼饲料中适宜的脂肪水平为15%, P/E为23.54 mg/kJ。     

维氏气单胞菌菌蜕疫苗免疫后鲤免疫应答与hepcidin基因表达特征

【目的】为探讨接种维氏气单胞菌菌蜕疫苗后鲤的应答反应特征及与甲醛灭活苗的效果比较,在实验条件下研究了接种疫苗后鲤(Cyprinus carpio)的特异性、非特异性免疫指标及hepcidin基因表达量的变化。【方法】在开始实验的第1、15和29天使用菌蜕疫苗(CLGs)和甲醛灭活疫苗(FKC)对鲤进行注射3次免疫,并设一个注射磷酸缓冲液(PBS)的对照组,每个组设3个重复。从第一次免疫后每隔7 d从每个重复中随机取三尾鱼进行取样,对血清抗体滴度、相对免疫保护率(RPS)、溶菌酶(LZM)、呼吸暴发、补体C3、髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)及hepcidin基因表达量进行测定。【结果】二次免疫后,CLGs组抗体凝集效价达2~6-2~8,显著高于FKC和PBS组(P0.05),且其呼吸暴发、LZM、MPO含量和hepcidin基因表达量显著高于PBS组(P0.05),MDA含量显著低于PBS组(P0.05);CLGs组C3含量在35和42 d显著低于PBS组(P0.05);FKC组MPO含量和hepcidin基因表达量显著低于菌蜕组(P0.05)。CLGs组的RPS为57.70%,FKC组RPS为30.77%。【结论】接种一定强度维氏气单胞菌菌蜕疫苗,能够提高鲤血清抗体效价和呼吸暴发、LZM、MPO等非特异性免疫指标及hepcidin基因表达,而且整体免疫效果好于甲醛灭活苗。     

pAd—SIG腺病毒质粒构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的含人生长抑素受体2亚型（ human somatostatin receptor subtype 2, hSSTr2 ）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）的腺病毒重组质粒的构建及表达。方法采用PCR方法将hSSTr2以及IRES-EGFP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle—CMV中,获得pShuttle-CMV／hSSTr2-EGFP,经PmeI酶切,去磷酸化后转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183菌,细菌内同源重组构建腺病毒质粒pAdeasy-1／hSSTr2．EGFP（pAd．SIG）,将其转染HEK293细胞进行病毒包装与滴度测定。重组腺病毒感染MCF-7细胞,流式细胞术检测其表达。结果酶切、PCR及基因测序证实重组腺病毒质粒pAd-SIG构建成功,病毒滴度为8．2&#215;10^9 IU／ml,流式细胞术结果显示hSSTr2在MCF-7细胞中表达阳性率为86．59％。结论成功构建了区组腺病毒质粒pAd-SIG,并能在真核细胞表达,为体内外研究hSSTr2效应提供了基础。     

锦鲤Hepcidin基因的克隆及其组织特异性表达分析

【目的】克隆锦鲤hepcidin全长cDNA序列(k-hepc),并获得此基因在鱼体内的表达模式。【方法】利用RT-PCR和RACE PCR的方法,从锦鲤肝脏中克隆锦鲤hepcidin的全长cDNA,进行序列测定和分析;锦鲤经肌肉注射维氏气单胞菌0、4、8、12、24和48 h后,分别取其肝、脾、肾、肠、脑、心、肌肉和鳃组织,采用实时荧光定量PCR的方法,以β-actin为内参基因,检测k-hepc基因的表达量。【结果】锦鲤抗菌肽(GenBank登录号KC795559)全长755 bp,编码序列276 bp,编码91个氨基酸,包括信号肽、原肽和成熟肽,成熟肽C端含有8个半胱氨酸,可形成4个分子内二硫键。与已报道的普通鲤鱼hepcidin氨基酸序列的一致性为93%,与其他鱼类hepcidin氨基酸序列的一致性为29%?93%。在本研究所检测的正常锦鲤的组织中,k-hepc均有表达,其中在肝组织中表达量最高,鳃组织中表达量最低。经维氏气单胞菌感染后,k-hepc在肝和心组织中的表达量明显增加,在其余组织中变化不显著。【结论】k-hepc编码的蛋白是Hepcidin家族的成员之一。锦鲤Hepcidin的表达主要受内在调节因素影响。     

亚麻油替代鱼油对杂交鲟生长、脂肪酸组成及脂肪代谢的影响

为研究亚麻油替代不同水平的鱼油后对杂交鲟(Acipenser baeri Brandt♀×A. schrenckii Brandt♂)幼鱼[初均重(70.8±0.5) g]生长、脂肪酸组成、肝脏及肌肉脂肪沉积以及脂肪代谢的影响, 在油脂添加量为8%的饲料中用亚麻油分别替代0(LO0)、25%(LO25)、50%(LO50)、75%(LO75)和100%(LO100)的鱼油, 配制5种等氮(38.7%CP)等脂(10%CF)饲料。每组饲料随机设3个重复, 养殖周期为12周。结果表明,亚麻油替代100%的鱼油对杂交鲟幼鱼的生长没有显著影响, 而且随着饲料中亚麻油含量的上升, 饲料效率有所提高, 100%鱼油替代组的饲料效率明显高于100%鱼油组的(P<0.05); 但用亚麻油替代鱼油后, 肌肉和肝脏的粗脂肪含量以及血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶活性明显升高(P<0.05); 肌肉亚麻酸和n-3多不饱和脂肪酸的含量与饲料中相应脂肪酸组成呈明显的线性相关关系(R2>0.69; P<0.05)。对于杂交鲟的脂肪代谢而言, 亚麻油的添加对血清中的游离脂肪酸、甘油三酯、高、低密度脂蛋白胆固醇的变化产生明显影响, 但亚麻油对血清总胆固醇和酮体影响不显著。考虑到亚麻油完全替代鱼油后, 肌肉中的EPA和DHA这两种长链高不饱和脂肪酸的含量仅下降了不到30%, 因此亚麻油应该是一种比较优质的鱼油替代品。